Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/106210
Modelització i estratègies de procés per a la producció de RhuA en escherichia coli / Jordi Ruiz i Franco ; directors Josep López Santín, Carles de Mas Racabayera i Glòria González Anadón
Ruiz Franco, Jordi
López Santín, Josep, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
Mas i Rocabayera, Carles de, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
González, Glòria, (González i Anadón), dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2012
Descripció: 1 recurs electrònic (211 p.)
Resum: Aquest treball es centra en l'estudi del procés de producció de la proteïna Ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) en cultius d'alta densitat cel·lular d'Escherichia coli M15ΔglyA [pREP-4] pQEαβrham i la seva posterior purificació i immobilització a partir de tècniques de cromatografia d'afinitat a metalls. L'estudi de diferents estratègies de procés en bioreactor a escala laboratori heretades de treballs anteriors al grup de recerca on s'emmarca aquest treball permeten determinar una estreta dependència entre les condicions d'operació amb què es du a terme el procés i la qualitat (UA·mg-1RhuA) de la proteïna recombinant sintetitzada així com els rendiments de purificació de la proteïna sobre suports de tipus IMAC. És per aquest motiu doncs, que s'avaluen diferents estratègies de procés alternatives amb l'objectiu de maximitzar la qualitat de la proteïna recombinant sintetitzada i mantenir elevats nivells de purificació i immobilització d'aquesta per al seu ús com a biocatalitzador. Un primer pas per a l'optimització de la qualitat proteica consisteix a modelitzar matemàticament la producció de la proteïna recombinant en cultius d'alta densitat cel·lular en bioreactors a escala laboratori amb l'objectiu d'identificar l'efecte de les principals variables operacionals sobre aquesta. La modelització es realitza sobre una estratègia de procés base diferent de les heretades de treballs anteriors, que permet obtenir qualitats proteiques de partida superiors i identifica l'acumulació de glucosa, principal font de carboni, com a possible causa de degradació proteica ben entrada la fase d'inducció del cultiu a partir d'IPTG. Per altra banda, l'efecte de la inducció sobre el creixement cel·lular i sobre la pròpia producció de RhuA planteja la necessitat de redefinir les estratègies de cultiu implementades durant l'etapa d'inducció responent a perfils d'alimentació lineals (no incrementals) front els exponencials pre-programats tradicionals i a l'addició de determinats aminoàcids, prèviament a la inducció (i després d'un estudi de l'estructura primària de la proteïna), per tal de minimitzar les respostes d'estrès cel·lular a la sobreexpressió de proteïna. La combinació d'aquestes estratègies a escala laboratori porten a l'avaluació de la viabilitat del procés a una major escala productiva (30 L) amb resultats prometedors (màxims nivells d'activitat enzimàtica produïda i increments considerables de la quantitat de proteïna intracel·lular acumulada front d'estratègies de cultiu estàndard) que obren les portes a posteriors estudis per tal d'explotar la potencialitat del procés.
Resum: This work focuses on the study of the production process of the protein Rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) in high cell density cultures of Escherichia coli M15ΔglyA [PREP-4] pQEαβrham and its purification and immobilization through immobilized metal ion affinity chromatography techniques. The study of different process strategies in a laboratory scale bioreactor inherited from previous work allowed to determine a close dependency between the operating conditions that the culture is carried out through and protein quality ( AU·mg-1RhuA) as well as immobilization yields on IMAC supports. For this reason then, several alternative process strategies were tested in order to maximize the quality of the recombinant protein synthesized and maintain high yields of purification and immobilization to effectively use it as a biocatalyst. A first step for protein quality optimization was achieved by mathematical modeling the production of Rhamnulose 1-phosphate aldolase in high cell density cultures of E. coli in laboratory scale bioreactors in order to identify the effect of main operational variables on it. Cultures performed to calibrate the mathematical model were carried out through specific process strategies different than those inherited from earlier studies. These strategies allowed to obtain better values of protein quality and also to identify accumulation of glucose, the main carbon source, as a possible cause of protein degradation at the end of the induction stage of the process. Moreover, the effect of induction on cell growth and on RhuA production itself raised the need to redefine process strategies to be implemented during the induction stage of the process. Linear feeding profiles versus traditional predefined exponential feeding profiles and the addition of certain amino acids, before the induction stage (as a result of the study of the primary structure of the recombinant protein), were implemented to minimize the stress responses to overexpression of protein. The combination of these strategies, effective at laboratory scale, was used to scale-up the process to a 30 L fermenter to determine the feasibility of the process at a larger productive scale. Results obtained were promising from a production of RhuA point of view since maximum values for enzymatic activity were achieved and considerably increase of the amount of intracellular accumulated protein (comparing with induction schemes at the same intensity) was detected. The results open the door to further studies to be done in order to fully exploit the potential of the process.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, 2012
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Escherichia coli ; Aldolasa ; Proteïnes ; Síntesi

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/96482


211 p, 1.6 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2013-04-11, darrera modificació el 2016-04-21



   Favorit i Compartir