Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/106895
Structural and functional studies of Melibiose permease of Escherichia coli / per Yibin Lin ; director: Esteve Padrós i Morell
Lin, Yibin
Padrós, Esteve, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2013
Descripció: 1 recurs electrònic (305 p.)
Resum: Els transportadors de membrana tenen un paper molt important en el manteniment de la fisiologia normal de l'organisme, així com en l'eficàcia i la seguretat dels fàrmacs. Per tant, és molt important obtenir noves dades de l'estructura i la funció d'aquest tipus de proteïnes de membrana. La melibiosa permeasa (MelB), un transportador de membrana, és de gran interès, ja que pot utilitzar diferents sucres (ja sigui α- o β-galactòsids) i cations (Na+, Li+ i H +), mentre que altres simportadors com la lactosa permeasa, un membre de la important superfamília de facilitadors, utilitza només H+. Això implica que la MelB ha de presentar algunes característiques úniques en quant al reconeixement i el transport dels substrats. L'estudi en profunditat de l'estructura i funció de la MelB ens pot proporcionar millores clau en la comprensió del mecanisme de co-transport dels transportadors de membrana. Les dades actuals d'índole bioquímica, biofísica o estructural de la MelB no ens proporcionen una escena clara del mecanisme de reconeixement de substrats, i tampoc expliquen la reorganització estructural que es produeix i que en última instància, genera els canvis conformacionals necessaris per al transport a través de la membrana. En aquesta tesi, he utilitzat tècniques espectroscòpiques, així com mètodes de cristal·lografia de macromolècules per explorar l'estructura i funció de la MelB. En primer lloc, m'he centrat en l'estudi del mutant R149C, el qual no pot unir el sucre i no pot transportar. En segon lloc, he estudiat el paper de l'hèlix V a partir de la substitució individual dels aminoàcids per cisteïna, per mutagènesi dirigida. Finalment, hem cristal·litzat el transportador MelB i hem aplicat difracció de raigs X per intentar obtenir la seva estructura 3D. Els resultats mostren que la mutació R149C fixa la MelB en una conformació oberta cap al citoplasma. Per tant, l'Arg149, situada probablement al final del cantó citoplasmàtic de l'hèlix V, és una cadena lateral crucial per al mecanisme de reorientació de la MelB. Un altra resultat important és que l'Ala155, situat probablement cap el punt mig de l'hèlix V, és un residu essencial tan per la unió de Na+ com de melibiosa, ja que el mutant A155C perd absolutament qualsevol capacitat d'unir els substrats. Per altra banda, es proposa que l'hèlix V ha d'estar involucrada en el mecanisme de reorientació de la MelB. Després de diversos intents de cristal·litzar la proteïna, hem estat capaços d'obtenir cristalls de la MelB silvestre i del mutant R149C, solubilitzats en β-29M. Després de l'optimització, el millor cristall difracta a uns 8 Å a la font de radiació sincrotró.
Resum: Membrane transporters play a very important role to maintain the normal physiology of the organism as well as in drug safety and efficacy. Therefore, it is very important to gain new information on the structure and function of this type of membrane proteins. Melibiose permease (MelB), a membrane transporter, is of great interest because it can use different sugars (either α- or β-galactosides) and cations (Na+, Li+, and H+), whereas other symporters like lactose permease, a member of the major facilitator superfamily uses only H+. This implies that MelB should present some unique substrate recognition and transport characteristics. The in-depth study of the structure and function of MelB may provide us with key advancements in the understanding of the cotransport mechanism of membrane transporters. The current biochemical, biophysical, and structural data for MelB fail to give us a clear scene of the substrates recognition mechanism, and to explain the structural reorganization that occurs and that ultimately forces the conformational changes needed for transport through the membrane. In this thesis, I used spectroscopic techniques as well as macromolecular crystallography methods to explore the structure and function of MelB. Firstly, I focused on the R149C mutant, which cannot bind sugar and cannot transport. Then I continued to study the role of helix V by cysteine scanning mutagenesis. Finally, I tried to crystallize the MelB transporter and apply X-ray diffraction to obtain its 3D structure. The results showed that the R149C mutation fixes the MelB in an inward-facing conformation. Therefore, Arg149, located probably in the cytoplasmic half of transmembrane helix V, is a crucial side chain for the reorientation mechanism of MelB. Ala155, located probably in the middle of helix V, is an essential residue for either Na+ or melibiose binding, since the mutant A155C absolutely loses the capability to bind substrates. The helix V should be involved in the reorientation mechanism of MelB from the outward-facing to the inward-facing conformation. After several attempts of crystallizing the protein, we were able to obtain crystals of MelB wt and R149C mutant solubilized in β-DDM. After optimization, the best crystal diffracted to about 8Å at the synchrotron radiation source.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2012
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Melibiosa ; Proteïnes de membranes ; Cristal·lització
ISBN: 9788449033803

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/107893


305 p, 13.5 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2013-06-04, darrera modificació el 2016-04-15



   Favorit i Compartir