Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/116382
Estudi de la via d'agregació de tres proteïnes implicades en diferents malalties conformacionals humanes : scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d'Alzheimer, AL‐12 com a causa d'amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com a organitzador del proteoma / Marta Marin Argany ; sota la direcció de la Dra. Sandra Villegas Hernández
Marin Argany, Marta
Villegas Hernández, Sandra, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2014
Descripció: 1 recurs electrònic (314 p.)
Resum: Aquesta Tesi Doctoral es centra en l'estudi molecular de tres proteïnes relacionades amb malalties conformacionals humanes, o Amiloïdosis. Mitjançant tècniques espectroscòpiques, s'han descrit els mecanismes de plegament natiu i d'agregació en fulla-β ordenada, dues vies que es troben en competència a través de la presència de diferents estats intermediaris a l'espai conformacional. Els intermediaris d'agregació, precursors de les fibres amiloides, són considerats els principals causants de la citotoxicitat cel·lular en moltes de les malalties amiloidogèniques, per tant, el seu estudi és crucial per aprofundir en l'etiologia d'aquestes patologies humanes, moltes d'elles sense tractament curatiu. Per una banda, s'ha obtingut un fragment d'anticòs recombinant específic per a β-oligòmers del pèptid Aβ1-42 causant de l'Alzheimer, l'scFv-h3D6. El seu estudi ha estat el primer en descriure el mecanisme pel qual un scFv retira el pèptid Aβ1-42 de la via amiloide i evita la seva toxicitat neuronal, tal i com s'ha demostrat en assajos de viabilitat en cultius cel·lulars. A més, l'obtenció d'un model tridimensional de l'scFv-h3D6, per homologia de seqüències, ha permès fer un redisseny racional de la molècula per tal de millorar-ne la seva estabilitat, augmentar la seva producció, i disminuir la dosi efectiva ja demostrada en ratolins model d'Alzheimer. Per altra banda, s'ha treballat amb un domini variable (VL) d'immunoglobulina, extret d'una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, l'AL-12. Aquest domini amiloidogènic presenta 7 mutacions respecte la seva línia germinal κI O18/O8. L'obtenció de les propietats termodinàmiques de l'AL-12, així com de quatre mutants restauratius, ha servit per estudiar l'efecte de les mutacions somàtiques sobre l'estabilitat dels dominis VL. Així, la restauració de residus puntuals de l'AL-12 cap a la seqüència germinal, implica la desestabilització del domini i un augment de la tendència a l'agregació i, per tant, s'ha demostrat que una única mutació somàtica no seria la causa del potencial amiloidogènic de l'AL-12, sinó que seria la combinació de varis factors desestabilitzants del plegament natiu, donant lloc a canvis conformacionals susceptibles a l'agregació amiloide, i la seva deposició en diferents òrgans i teixits cel·lulars. I per últim, s'ha estudiat el domini PSD95-PDZ3, una molècula reguladora de la sinapsis neuronal, i relacionada amb malalties com l'Alzheimer o l'Autisme. El domini PDZ3 segueix una via d'agregació amiloide reversible, una particularitat rellevant de la qual se n'han determinat els canvis conformacionals que la promouen. A més, el disseny de 6 variants del PDZ3 han servit per determinar les regions implicades en l'estabilitat i plegament global del domini, així com el seu paper en la regulació al·lostèrica de l'activitat del domini. Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l'espai conformacional de les proteïnes, la seva relació amb les malalties conformacionals, i l'aplicabilitat del seu coneixement en el desenvolupament de teràpies efectives.
Resum: The thesis here presented is focused on the molecular study of three human proteins related to conformational diseases, or Amyloidoses. The mechanisms of native folding and aggregation in a cross-β sheet structure have been described using several spectroscopic techniques. These two pathways are competing by the presence of intermediate states of the reaction. An oligomeric intermediate is the precursor of the β-aggregates and is considered the main responsible of the cellular toxicity in many amyloid diseases. Therefore, is necessary to perform a deeper study of the oligomeric state to delve into the etiology of these human diseases. On one hand, the expression and extraction of a single-chain variable fragment (scFv-h3D6), a derivative of an antibody specific for Aβ-oligomers, was performed. Here is the first description of a conformational mechanism by which a scFv-h3D6 withdraws Aβ1–42 oligomers from the amyloid pathway and, consistently, it prevents Aβ-oligomer toxicity in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Moreover, we modeled the 3D-structure of scFv-h3D6, obtained by sequence homology. This model has allowed to a rational redesign of the molecule in order to improve its stability, increase its recombinant production, and decrease the effective dose already demonstrated in a mice model of Alzheimer's disease. For another hand, we studied the AL-12 protein, an Ig variable domain (VL) obtained from a patient diagnosed with light chain Amyloidoses. This amyloidogenic domain shows seven non-conservative mutations from his germinal protein κI O18/O8. The thermodynamic study of AL-12 and four restoratives mutants, allowed us to determine the effect of somatic mutations on the VL stability. Thereby, the restoration of a residue toward the germinal sequence implies a destabilization of the domain and increases the aggregation tendency. Here we demonstrate that a single somatic mutation couldn't be the cause of the amyloidogenic potential of AL-12, rather it is due to several factors. The destabilization of the native folding promotes a conformational reorganization more susceptible to β-aggregation. Finally, we work with PSD95-PDZ3 domain, a neuronal post-synaptic protein and related to human disease such as Alzheimer or Autism. PDZ3 follows a reversible aggregation pathway, a feature which is relevant to determining the conformational changes that promote it. In addition, the design of six variants of PDZ3 has helped determine the regions involved in the folding and stability of the global PDZ3 domain and its role in the aggregation process. This work demonstrates the importance of the states in the intermediate conformational space of proteins, their relationship with conformational diseases, and the application of knowledge in the development of effective therapies.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2013
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Immunoterapia ; Proteïnes ; Agregació ; Amiloïdosi
ISBN: 9788449039423

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/129329


314 p, 3.7 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2014-03-04, darrera modificació el 2016-04-15



   Favorit i Compartir