Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/126974
Linker histone post-translational modifications and effects of phosphorylation on secondary structure and chromatin aggregation
Lopez Ramos, Rita
Ponte Marull, Immaculada, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
Roque Córdova, Alicia, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2014
Descripció: 1 recurs electrònic (211 p.)
Resum: Les histones linker juguen un paper important en l'organització i manteniment de la cromatina en estructures d'ordre superior i en la regulació transcripcional. La histona H1 en vertebrats té una estructura característica en tres dominis: un domini N-terminal curt i flexible; un domini globular central; i un domini C-terminal llarg. Els dominis N- i C-terminals (CTD) són molt bàsics i es troben desestructurats en solució aquosa. La distribució de càrrega és bastant uniforme al llarg de tot el CTD. La interacció amb el DNA indueix un plegament total i estable del CTD en condicions fisiològiques, fet que permet classificar aquest domini en el grup de les proteïnes intrínsecament desordenades, on el plegament i la unió al lligand estan acoblades. La fosforilació post-traduccional del CTD de la H1 té efectes en l'estructura secundària de la proteïna i en la condensació del DNA. L'estructura secundària de la H10 sencera es va analitzar per espectroscòpia d'infrarroig. La H10, igual que el CTD aïllat, també es plegà degut a la interacció amb el DNA i l'estructura secundària també va ser modulada per fosforilació. El canvi estructural induït per la fosforilació va consistir en un increment de la quantitat d'estructura β, que va esdevenir més significant amb la unió a DNA, on també es va observar una dependència d'aquest increment amb la relació proteïna/DNA. En aquest cas, la proporció d'estructura β va arribar al 54%, suggerint que el CTD en la proteïna sencera presentava una conformació tot-β. Simultàniament, es va observar una reducció significant de l'estructura en hèlix-α, fet que va suggerir una disminució d'aquest element estructural en el domini globular, probablement per la propagació de l'estructura β des del CTD cap a la resta de la proteïna. En presència de SDS, la H10 es va plegar amb percentatges d'estructura secundària similars als observats en la unió al DNA. A una relació molar SDS/proteïna 14:1, la H10 trifosforilada presentava un 55% d'estructura β, indicant que el CTD en la histona H10 també es trobava en una conformació tot-β i formava fibres amiloides. Els nuclis d'eritròcit de pollastre contenen cromatina inerta i altament compacta consistent, principalment, en DNA i proteïnes histona. En aquest estudi, es va emprar aquesta cromatina per analitzar les modificacions post-traduccionals de les histones i l'efecte de la fosforilació per CDK2 en l'agregació de la cromatina. Els nuclis es van digerir amb nucleasa micrococcal i la cromatina es va fraccionar per centrifugació en tampó de baixa força iònica en fraccions soluble i insoluble. Les modificacions post-traduccionals (PTMs) de les histones linker purificades d'ambdues fraccions es van analitzar per Tandem MS. Els sis subtipus d'histona H1 i la histona H5 van ser identificats. En aquest estudi, es van trobar vuit PTMs novells: dues a la histona H5 i sis en els subtipus d' H1. Algunes de les modificacions van ser identificades específicament en una de les fraccions, suggerint una distribució diferencial d'algunes PTMs en la cromatina. La comparació de les PTMs novells identificades amb altres prèviament descrites en altres espècies va demostrar que la majoria d'elles estan conservades en l'evolució. Atès que les histones linker desenvolupen la seva funció en la cromatina, es va fosforilar ex vivo amb CDK2 els motius S/T-P-X-Z de les histones linker presents en la cromatina d'eritròcit de pollastre; amb l'objectiu d'estudiar l'efecte de la fosforilació en l'agregació de la cromatina. L'anàlisi proteòmic per HPCE i MALDTOF-MS va mostrar que el nombre de grups fosfat va augmentar amb el temps de fosforilació, assolint un 54% d'espècies fosforilades (mono- i di-fosforilades) en el cas de la H5 després de la fosforilació overnight. Experiments de Tandem MS van revelar que, en cap de les histones purificades de la cromatina nativa, cap dels motius S/T-P-X-Z estava fosforilat, indicant que la fosforilació detectada en les mostres tractades amb CDK2 havien estat modificats ex vivo. En H5, nomes S148 va identificar-se en totes les mostres i es trobava fosforilat després d'1 hora. En l'anàlisi per TandemMS de les H1, tots els motius consens de CDK2, excepte S171 (posició en H1. 01), es van identificar en els subtipus H1. 03, H1. 1L i H1. 1R. H1. 03T16 es va trobar fosforilat després de 15 minuts; H1. 1LS192 I H1. 1RS186 després d'1 hora; H1. 03S155, H1. 1LS155 i H1. 1RS153 després de 3 hores. Un cop la fosforilació ex vivo de les histones en la cromatina es va comprovar, es va procedir a estudiar l'efecte de la fosforilació en l'agregació de la cromatina induïda per MgCl2 (1. 6mM) per Dynamic Light Scattering (DLS). El resultat més significant associat a la fosforilació va ser la disminució del diàmetre hidrodinàmic de les molècules agregades. Aquestes diferències van esdevenir més important amb l'augment del temps de fosforilació i amb la mida dels fragments de cromatina. Els resultats obtinguts van demostrar que la fosforilació de les histones linker impedia l'agregació de la cromatina.
Resum: Linker histones play an important role in establishing and maintaining chromatin higher-order structure and in transcriptional regulation. Histone H1 in vertebrates has a characteristic three-domain structure consisting of a short flexible N-terminal domain, a central globular domain and a long C-terminal domain. The amino- and carboxyl-terminal (CTD) domains are highly basic and mainly unstructured in aqueous solution. The charge distribution is quite uniform along the CTD. Because of that, chromatin condensation is mediated through charge-neutralization of the negatively charged linker DNA, facilitating chromatin condensation into the 30nm fibre and also intermolecular aggregation. Interaction with DNA induces the complete folding of the CTD under physiological conditions in a very stable manner, which allows to classify this domain as an intrinsically disordered protein, with coupled binding and folding. Post-translational phosphorylation of the CTD of H1 has effects on secondary structure and DNA condensation. Secondary structure of the entire H10 was analysed by infrared spectroscopy. H10, as the isolated CTD, also folded upon DNA interaction and the secondary structure was modulated by phosphorylation. The structural change following phosphorylation was characterized by an increase in the amount of β‐structure that was more significant when bound to DNA and was dependant on the protein/DNA ratio. The proportion of β‐structure reached 54 % suggesting that the CTD was in an all‐β conformation in the entire protein. Concomitant with the increase in β‐structure, there was a remarkable decrease of α‐helix that suggested the loss of some of the α‐helix in the globular domain; probably associated to the propagation of the β‐structure from the CTD towards the rest of the protein. In the presence of SDS, H10 folded with percentages of secondary structure motifs similar to those found when bound to DNA. At a molar ratio 14:1 (SDS/protein) the triphosphorylated protein had 55% of β‐structure indicating that the CTD within histone H10 was also in an all‐β conformation and formed amyloid fibres. Mature chicken erythrocyte nuclei contain highly condensed and inert chromatin, mainly consisting of DNA and histone proteins. Chicken erythrocyte chromatin was used to analyse linker histones post-translational modifications and the effect of phosphorylation by CDK2 on chromatin aggregation. The nuclei were digested with micrococcal nuclease and fractionated by centrifugation in low-salt buffer into soluble and insoluble fractions. Post-translational modifications (PTMs) of the purified linker histones of both fractions were analyzed by Tandem MS. All six histone H1 subtypes (H1. 01, H1. 02, H1. 03, H1. 10, H1. 1L and H1. 1R) and histone H5 were identified. In our study, we identified eight novel post-translational modifications: two were identified in histone H5 and six in histone H1 subtypes. Some of the identified modifications were specific of one chromatin fraction suggesting the differential distribution of some PTMs within chromatin. Comparison of the PTMs found with other previously reported for other species showed that most of them are conserved through evolution. Since histone H1 develops its function within chromatin; chicken erythrocyte chromatin was phosphorylated ex vivo with CDK2 in the S/T-P-X-Z motifs present in linker histones in order to study the effects of ex vivo phosphorylation of linker histones on chromatin aggregation. Proteomic analyses by HPCE and MALDITOF-MS showed that the the number of phosphate groups increased with the time of phosphorylation, reaching, in the case of H5, 54% of phosphorylated species (mono and diphosphorylated) after overnight phosphorylation. Tandem MS after proteolytic digestion revealed that in all linker histones the S/T-PX-Z motifs were unphosphorylated in native chromatin indicating that the phosphorylated peptides found at other times of reaction were modified ex vivo. In H5, only S148 was identified in all samples and was phosphorylated after 1 hour. In the Tandem MS analysis of histone H1 subtypes, all the CDK2 consensus sequences, except S171(H1. 1R numbering) were identified for H1. 03, H1. 1L and H1. 1R. H1. 03T16 was found phosphorylated after 15 minutes; H1. 1LS192 and H1. 1RS186 after 1 hour; H1. 03S155, H1. 1LS155 and H1. 1RS153 after3 hours. Once ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was confirmed, the effect of linker histones ex vivo phosphorylation on chromatin aggregation induced by MgCl2 (1. 6 mM) was analysed by Dynamic Light Scattering (DLS). The most remarkable result associated to ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was a decrease in the hydrodynamic diameter of the aggregated molecules. The differences became greater with the increase of phosphorylation time and with the size of the chromatin fragments. These results indicated that linker histones phosphorylation impaired chromatin aggregation.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2013
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: Histone H1 ; Phosphorylation ; Post.translational modifications
ISBN: 9788449042331

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/131313


211 p, 2.4 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2014-12-14, darrera modificació el 2016-06-04



   Favorit i Compartir