Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/127000
Estudi sobre l'efecte de BHRF1 en la inhibició de l'apoptosi i el control del cicle cel·lular en cèl·lules d'hibridoma
Milián González, Ernest
Gòdia i Casablancas, Francesc, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
Cairó i Badillo, Jordi Joan, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
Vives Armengol, Joaquim, dir.
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2014
Descripció: 1 recurs electrònic (239 p.)
Resum: En l'actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d'elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l'activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa a l'ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l'activació del procés de mort cel·lular programada o apoptosi. La principal causa de l'activació d'aquest tipus de mort cel·lular és l'esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l'acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En aquest treball, s'han utilitzat cèl·lules murines d'hibridoma KB26. 5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s'ha comprovat com aquesta modificació és capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un període on hi ha una situació d'inducció a l'apoptosi. Aquesta capacitat s'ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com són el discontinu i la perfusió. Aquest últim sistema de cultiu s'ha posat en evidència que, a més de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitació de nutrients. Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l'expressió d'aquest gen víric era capaç de produir aquests efectes fenotípics. S'ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l'aturada de l'apoptosi a nivell mitocondrial, sinó que és capaç d'influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula. Les anàlisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d'induir de forma diferencial l'expressió de gens relacionats amb l'apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A més, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l'apoptosi, es produeix una sobreexpressió de bcl2 en les cèl·lules KB26. 5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relació entre les dues proteïnes codificades per aquests gens. Per tal de veure els efectes de la sobreexpressió de bcl2 s'han utilitzat inhibidors químics específics per la proteïna Bcl-2. Com a resultat s'ha anul·lat la resistència a l'apoptosi per part d'aquelles cèl·lules amb expressió de BHRF1. La sobreexpressió de bcl2 es pot relacionar, a més, amb l'aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1. La relació entre BHRF1 i Bcl-2 no s'ha constatat a través d'una interacció directa, ja que tant sols s'han vist interaccions de BHRF1 amb la proteïna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservació de la integritat mitocondrial que s'ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l'apoptosi en condicions d'estrès. En aquest treball s'ha determinat també que BHRF1 és una proteïna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localització cel·lular tant en un context d'alta viabilitat cel·lular com d'apoptosi, per tant les interaccions proteiques s'han de donar a nivell del mitocondri.
Resum: Now a day the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of elevated therapeutic interest products as well as biological model for the assay of novel drugs. Many corporations use this technology as the best approach to obtain complex molecules. Notwithstanding there are several important drawbacks on the animal cell culture. Among them there is the loose of viability in cultured cells due to the activation of the programed cell death or apoptosis. The main origin of the apoptosis triggering is the essential nutrient or growth factors deprivation and the accumulation of harmful metabolites during the cell culture. Apoptosis represents a major inconvenient for the in vitro cell culture in bioreactors as is responsible for the dramatic cell viability reduction and consequently a decrease in productivity. The IgG3 producing murine hybridoma cells KB26. 5 have been used in this thesis. These cells have been transfected with bhrf1 gene and it was checked that this particular modification was able to reduce the number of apoptotic cells and ensure cell survival in proapoptotic conditions. This ability was observed in two cell culture systems such as batch and perfusion. The later culture system clearly showed that BHRF1 directly affects to the cell cycle only in a nutrient limitation situations. These observations led to a deep study of the BHRF1 intracellular effects to understand how the expression of this gene was able to generate those phenotypical effects. It was determined that the cellular effect of BHRF1 was not only constricted to prevent the apoptosis by itself at a mitochondrial level, but also was able to influence on several essential pathways. Microarray analysis unveiled the BHRF1 capability to differentially induce gene expression related to apoptosis, cell cycle, Akt/mTOR and JNK pathways. Moreover studies using real time PCR showed, only under apoptotic conditions, an over expression of bcl2 in KB26. 5 transfected cells with bhrf1 gene. This indicates that exist a relationship between both proteins. In order to see the effect of the bcl2 overexpression two chemical inhibitors for Bcl-2 were used; BHRF1 expressing cells did not exhibit apoptosis resistance. The overexpression of bcl2 can be related with G1 arrest observed under apoptotic conditions in BHRF1 expressing cells in the cell culture systems used. It was not determined a direct interaction between BHRF1 and Bcl-2, even though a direct interaction between BHRF1 and the proapoptotic protein Bim and the JNK pathway related protein VRK2 were observed. Those interactions must take place in the mitochondria as it was observed that BHRF1 was a fully mitochondrial protein.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, 2013
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: BHRF1 ; Apoptosi ; Hibridoma
ISBN: 9788449042324

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/131457


239 p, 4.8 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2014-12-14, darrera modificació el 2016-06-04



   Favorit i Compartir