Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/131827
Strategies for improving production levels of HIV-1 VLPs by transient transfection of HEK 293 suspension cultures
Cervera Garcia, Laura
Gòdia Casablancas, Francesc, dir.
Segura, M. Mercedes, dir.
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2015
Descripció: 1 recurs electrònic (162 p.)
Resum: Les partícules similars a virus (VLP) ofereixen un gran potencial com a candidates per a la nova producció de vacunes. En aquest treball es presenta el desenvolupament i l'optimització d'un protocol de producció de VLP de Gag d'VIH-1 mitjançant l'expressió gènica transitòria en cultius de cèl·lules HEK 293 en suspensió. La transfecció transitòria permet una generació ràpida de proteïnes recombinants en quantitat i qualitat suficient per realitzar assajos preclínics, i és particularment interessant en les fases primerenques del desenvolupament. Aquest treball es divideix en quatre capítols principals. Al primer capítol, el medi comercial lliure de sèrum Freestyle 293 s'optimitza mitjançant l'ús de components d'origen no animal. L'ús de medis químicament definits i sense components derivats d'animals és un requisit bàsic per una vacuna destinada als éssers humans. La densitat cel·lular màxima assolida utilitzant el medi de cultiu optimitzat (suplementat amb 0,9X de mescla de lípids, 19,8 mg/L d'insulina recombinant i 1,6 mg/L de transferrina recombinant) és 5,4×106 cèl·lules/ml en discontinu, gairebé el doble del que s'assoleix utilitzant el medi sense suplementar (2. 9×106 cèl·lules / ml). A més a més, després de l'optimització del medi, també s'ha millorat el protocol de transfecció. La millor producció s'aconsegueix quan les cèl·lules es transfecten a la meitat de la fase logarítmica (2-3 x 106 cèl·lules/ml) amb recanvi de medi en el moment de la transfecció utilitzant 1 g/(ml de cultiu) d'ADN i 2 g/(mL de cultiu) de polietilenimina. Mitjançant l'ús d'aquest protocol, els títols de VLP es van incrementar 2,4 vegades, obtenint 2,7 × 109 VLP/ml. Tant el medi de cultiu optimitzat com el protocol de transfecció s'utilitzen a la resta del treball. Al capítol dos, la cinètica del procés de transfecció transitòria s'estudia amb l'objectiu de caracteritzar i comprendre el procés complet a nivell intracel·lular que condueix a la producció de VLP, per tal de determinar els punts importants per poder millorar el procés. Els poliplexes comencen a interactuar amb la membrana cel·lular just després de la seva addició al cultiu. Després d'una hora i mitja es detecten al citoplasma de les cèl·lules i arriben al nucli al voltant de 4 hores després de la transfecció. Després de 10 hores es pot detectar la fluorescència GFP dins de les cèl·lules, però no s'observa la sortida de les VLPs de les cèl·lules, per gemmació, fins 48 hores després de la transfecció. El moment òptim de recollida del producte s'ha fixat a les 72 hores post transfecció ja que la producció de VLPs és màxima mentre es manté una viabilitat del cultiu alta. Al capítol 3, s'estudia la millora de la producció de VLPs utilitzant compostos específics. Es proven dos grups de potenciadors de la transfecció, un grup utilitzat per facilitar l'entrada de complexes de ADN/PEI a la cèl·lula o al nucli i un altre grup seleccionat per augmentar els nivells d'expressió gènica. Entre els vuit additius utilitzats (tricostatina A, àcid valproic, butirat de sodi, DMSO, acetat de liti, cafeïna, hidroxiurea i Nocodazol) s'identifica una combinació òptima que permet obtenir el màxim d'expressió. L'addició de 20 mM d'acetat de liti, 3,36 mM d'acid valproic i 5,04 mM de cafeina augmenta els nivells de producció 4 vegades, mentre la viabilitat del cultiu es manté al 94%. Atès que l'expressió transitòria (TGE) es basa en l'expressió episomal d'ADN plàsmidic, està limitada a un període curt de producció, d'en general unes 96 h, fet que limita la productivitat. Al capítol 4, es desenvolupa un protocol nou, anomenat expressió gènica extesa (EGE). L'objectiu de l'EGE és perllongar el període de producció, combinant el recanvi de medi i la transfecció repetida del cultiu per millorar la producció de proteïnes. L'avantatge d'aquesta metodologia és avaluada per a la producció de tres productes recombinants model: la GFP intracel·lular, la GFP secretada, i una partícula similar a virus Gag-GFP (VLP). Utilitzant aquesta nova estratègia EGE, el període de producció es perllonga entre 192 i 240 h amb un augment de producció d'entre 4-12 vegades en els nivells de producció, depenent del tipus de producte considerat.
Resum: Virus-like particles (VLPs) offer great potential as candidates for new vaccine production. In this work, the development and optimization of an HIV-1 Gag VLP production protocol by transient gene expression in HEK 293 suspension cultures is presented. Transient transfection enables a rapid generation of recombinant proteins of sufficient quantity and quality to perform pre-clinical trials, and it is particularly VLP production, and to determine important time points to drive process improvement. Polyplexes start to interact with the cell membrane just after addition to the culture. After 1. 5 hpt complexes are detected in the cytoplasm of the cells and reach the nucleus around 4 hours post transfection. After 10 hours post transfection GFP fluorescence is detected inside the cells, but generalized budding of VLPs from the cells is not observed until 48 hours post transfection. The optimal harvest time is determined as 72 hpt as VLP production is highest while high viability of the culture is maintained. In chapter three, the enhancement of VLP production using specific compounds is studied. Two main groups of transfection enhancers are tested, selected on the basis that they can either facilitate the entry of PEI/DNA transfection complexes into the cell or nucleus or they can increase the levels of gene expression. Among the eight transfection-enhancers tested (Trichostatin A, Valproic acid, Sodium Butyrate, DMSO, Lithium Acetate, Caffeine, Hydroxiurea and Nocodazole) an optimal combination of compounds exhibiting the greatest effect on gene expression is subsequently identified. The addition of 20 mM Lithium Acetate, 3. 36 mM Valproic Acid and 5. 04 mM Caffeine increases production levels by 4 fold, while maintaining cell culture viability at 94 %. As transient gene expression (TGE) is based on episomal plasmid DNA expression, conventional TGE is limited to a short production period of usually about 96 h, therefore limiting productivity. In chapter four, a novel gene expression approach termed extended gene expression (EGE) is proposed. The aim of EGE is to prolong the production period by the combination of medium exchange and repeated transfection of cell culture with plasmid DNA to improve overall protein production. The benefit of this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered. interesting in the early development phases. This work is divided in four main chapters. In the first chapter, the serum-free commercial medium Freestyle 293 is optimized using non-animal derived components as supplements. The use of chemically defined animal derived component free media and supplements is a basic requirement for any further use of a vaccine for humans. The maximum cell density attained using the optimized medium (supplemented with 0. 9X of Lipid mixture, 19. 8 mg/L of r-insulin and 1. 6 mg/L of r- transferrin) was 5. 4 × 106 cells/mL in batch mode, almost double of that observed using the unsupplemented medium (2. 9×106 cells/mL). Moreover, after the medium optimization, the transfection protocol is also improved. Best production performance is attained when cells were transfected at mid-log phase (2–3 × 106 cells/mL) with medium exchange at the time of transfection using 1 μg/(mL of culture) of plasmid DNA and 2 μg/(mL of culture) of polyethylenimine. By using this protocol, VLP titers are increased 2. 4-fold, obtaining 2. 7 × 109 VLPs/mL. The optimized medium and transfection protocol defined in this chapter are used in the rest of the work. In chapter two, the kinetics of the transient transfection process is studied with the aim to characterize and understand the complete process at intracellular level leading to the this methodology is evaluated for the production of three model recombinant products: intracellular GFP, secreted GFP, and a Gag-GFP virus-like particle (VLP). Using this novel EGE strategy, the production period is prolonged between 192 and 240 h with a 4–12-fold increase in production levels, depending on the product type considered.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química, 2015
Drets: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: Transfecció transitòria ; Transfección transitoria ; Transient transfection ; Partícules similars a virus ; Partículas como virus ; Virus-like particles ; Cél·lules de mamífer ; Células de mamífero ; Mammalian cell culture
ISBN: 9788449052538

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/289626


162 p, 4.7 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2015-04-27, darrera modificació el 2016-06-04



   Favorit i Compartir