Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/149400
Producció enantioselectiva de diols vicinals i α-hidroxicetones amb oxidoreductases de llevat : aplicació de tècniques d'autoclonació per la generación d'enzims i soques modificades / memòria presentada per Eduard Calam Cervera ; sota la direcció del doctor Josep Antoni Biosca Vaqué
Calam Cervera, Eduard
Biosca Vaqué, José Antonio, dir
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2015
Descripció: 1 recurs electrònic (222 p.) : il., gràf
Resum: Les transformacions catalitzades per enzims s'utilitzen cada cop més per a la síntesis d'intermediaris útils destinats a les indústries farmacèutiques, agroalimentàries i de química fina. La utilització d'enzims en síntesi química compleix amb els principis de la "química verda", com per exemple en la utilització de solvents més segurs (les reaccions enzimàtiques són realitzades usualment, en medi aquós), en el disseny de reaccions amb millor eficiència energètica (les reaccions enzimàtiques es realitzen, sovint, a T ambient), i en la utilització de catalitzadors (els enzims ho són) entre d'altres. La majoria de molècules amb interès farmacèutic o emprades en la "química fina" posseeixen al menys un centre quiral i donades les propietats de quimioselectivitat, regioselectivitat i estereoselectivitat dels enzims, fan que aquests siguin òptims, per a la síntesi d'aquestes molècules. Diversos diols, com 1,3-propàdiol, 1,2-propàdiol, 2,3-butàdiol i 1,4-butàdiol, es consideren productes químics bàsics ("plattform chemicals") a causa de les seves moltes aplicacions en la indústria, incloent la síntesi de productes químics especials i el seu ús com a precursors de polímers. A més, el 2,3-butàdiol s'ha utilitzat com un agent anticongelant (la forma de l'estereoisòmer (2R,3R)-2,3-butàdiol té un punt de congelació -60 ° C) i com un precursor de diversos compostos, a través de reaccions de deshidratació (obtenint metil etil cetona, que es pot utilitzar com un additiu de combustible), deshidrogenació (donant compostos aromatitzants com acetoïna i diacetil) i esterificació (donant precursors de fàrmacs i plastificants) En el nostre laboratori hem caracteritzat l'enzim Bdh1p de Saccharomyces cerevisiae, implicat en la síntesi de acetoïna i 2,3-butàdiol, que són productes del metabolisme del llevat. També hem caracteritzat l'activitat diacetil reductasa depenent de NADH dels enzims Bdh1p i Adh2p; així com l'activitat diacetil reductasa depenent de NADPH de l'enzim Ara1p. El primer objectiu d'aquesta Tesi és emprar el potencial biotecnològic de Bdh1p en la síntesi de molècules amb dos grups hidroxil veïns amb configuració R, en concret: (2R,3R)-2,3-butàdiol, (2R,3R)-2,3-pentàdiol, (2R, 3R)-2,3-hexàdiol i (3R,4R)-3,4-hexàdiol. Aquesta síntesi s'ha fet a partir de precursors (dicetones) i a diferents nivells: enzims purs (incloent enzims de regeneració de coenzim), soques de llevat que els sobre-expressen i una proteïna de fusió entre Bdh1p i formiat deshidrogenasa. El segon objectiu de la Tesi és estudiar la estereoselectivitat de diferents aldo-ceto reductases (tant de llevat, com humanes) i la seva utilització en la síntesi d'hidroxicetones i diols derivats de dicetones veïnes. El tercer objectiu de la Tesi és desenvolupar una tècnica d'autoclonació per llevat que permeti introduir mutacions específiques en el DNA, sense la introducció d'elements extra que pertorbin el context cromosomal dels gens. El seu ús en soques industrials evitarà la presència de gens que produeixin resistència a antibiòtics i en general de DNA forà a l'organisme. Aquesta tècnica s'ha aplicat per la construcció de soques de llevat que sobre-expressin Bdh1p des de un promotor activable per galactosa. També s'ha utilitzat per introduir mutacions específiques en el gen ADH1de llevat, de manera que s'alteri la seva preferència de coenzim. S'han estudiat els efectes d'aquestes mutacions puntuals en les corbes de creixement de les soques de llevat modificades, en diferents fonts de carboni.
Resum: Summary The transformations catalyzed by enzymes are increasingly used for the synthesis of intermediates used in pharmaceutical, food processing and fine chemicals. The use of enzymes in chemical synthesis complies with the principles of "green chemistry", such as the use of safer solvents (enzymatic reactions are usually performed in aqueous medium), the design of reactions with greater efficiency in the use of energy (enzymatic reactions are performed often at ambient T), and the use of catalysts (as enzymes are). Most molecules with pharmaceutical interest or used in "fine chemical" have at least one chiral center and given the properties of chemoselectivity, regioselectivity and stereoselectivity of enzymes, make them an optimal choice for the synthesis of these molecules. Several diols such as 1,3-propanediol, 1,2, 2,3 and 1,4-butanediol are considered basic chemicals ("Plattform chemicals") because of their many applications in industry, including the synthesis of specialty chemicals and their use as precursors of polymers. In addition, 2,3-butanediol has been used as an antifreeze agent (the stereoisomeric form (2R, 3R) -2,3-butanediol has a freezing point of -60 ° C) and as a precursor of several compounds through reactions of dehydration (obtaining methyl ethyl ketone, which can be used as a fuel additive) dehydrogenation (giving flavoring compounds, as acetoin and diacetyl) and esterification (giving precursors of drugs and plasticizers). In our laboratory, we characterized the enzyme Bdh1p from Saccharomyces cerevisiae involved in the synthesis of acetoin and 2,3-butanediol, which are products of the metabolism of the yeast. We have also characterized the diacetyl reductase activities, NADH-dependent of Bdh1p, Adh2p as well as the diacetyl reductase activity of the NADPH-dependent enzyme Ara1p. The first objective of this thesis is to use the potential biotechnological use of Bdh1p in the synthesis of molecules with two neighbors hydroxyl groups, in R configuration, namely: (2R, 3R) -2,3-butanediol (2R, 3R) -2 3-pentanediol (2R, 3R) -2,3-hexanediol and (3R, 4R) -3. 4-hexanediol. These syntheses were made from precursors (diketones) at different levels: pure enzymes (including enzymes for coenzyme regeneration) yeast strains that over-express a fusion protein between Bdh1p and formate dehydrogenase. The second aim of the thesis is to study the stereoselectivity different aldo-keto reductase (both yeast and human) and their use in the synthesis of diols and hydroxy derivatives diketone neighbors. The third objective of the thesis is to develop a technique that allows "self-cloning" in yeast to introduce specific mutations in DNA, without introducing extra elements that disturb the context of chromosomal genes. Its use in industrial strains avoids the presence of genes that cause antibiotic resistance and overall foreign DNA of the organism. This technique has been applied to the construction of yeast strains that over-express Bdh1p from a promoter activated by galactose. It has also been used to introduce specific mutations in the yeast gene ADH1, which altered its preference for the coenzyme. We also studied the effects of these mutations on the growth curves of the modified yeast strains in different carbon sources.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2015
Drets: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: Llevats ; Enzims ; Oxidoreductases
ISBN: 9788449027307

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/330367


4.8 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2016-04-25, darrera modificació el 2016-06-04



   Favorit i Compartir