| Resum: |
La histona H1 es necesaria para la condensación de la cromatina y puede estar implicada en la activación y en la inhibición de genes específicos. La histona H1 está codificada por una familia multigénica. En los mamíferos hay seis subtipos somáticos, H1a-e y H1º, una variante específica de la línea germinal masculina, H1t, y una variante propia de los oocitos, H1oo Hemos estimado las afinidades relativas de los seis subtipos somáticos de mamífero, H1a-e y H1º, por la SAR del agrupamiento de los genes de las histonas de Drosophila y por un fragmento de pUC19 de similar longitud, mediante un ensayo de competición de dos subtipos presentes en similar concentración por una cantidad limitada de DNA. El orden de afinidades por la SAR fue H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), donde el número entre paréntesis es la afinidad relativa expresada en relación al subtipo de unión más débil, la H1a. El orden de afinidades por el fragmento de pUC19 fue H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). Las afinidades relativas de los subtipos por la SAR y el pUC19 son similares. Es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad. Experimentos de desplazamiento de un subtipo unido al DNA por otro subtipo añadido posteriormente confirman cualitativamente el orden de afinidades obtenido de los experimentos de equilibrio. Experimentos de competición entre el fragmento SAR y el fragmento de pUC19 por una cantidad limitada de uno de los subtipos de la H1 muestran que todos los subtipos somáticos, H1a-e y H1º, comparten el carácter de proteína de unión a las SAR Las afinidades de cada uno de los subtipos por el DNA están determinadas a la vez por las características de cada subtipo y de las secuencias de DNA a las que se unen. La perturbación del complemento de H1 de la cromatina nativa mediante la adición de subtipos de la H1 exógenos, en presencia de SAR para mantener la estequiometría de la H1 en la cromatina, ha permitido estimar las afinidades relativas de los subtipos H1a-e y H1º por la cromatina. El orden de afinidades expresado en relación a la H1a fue H1a (1. 0)<H1b (4. 1)<H1c (6. 2)<H1e (15. 3)<H1º (16. 6)<H1d (19. 0). Las afinidades relativas son similares a las obtenidas para el DNA. Como en el caso del DNA, es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad. Los experimentos de condensación de los fragmentos de la SAR, el PUC19 y el pBR322 con PEG, que condensa el DNA por efecto del volumen excluido, demuestran que las características estructurales y/o mecanoelásticas del propio DNA determinan en gran medida la tendencia a la condensación ordenada que da lugar al espectro y. La condensación mediante ligandos catiónicos, histonas H1c y H1e, que neutralizan la carga de los fosfatos del DNA, confirma esta conclusión, pues la intensidad de los espectros y de los complejos de los diferentes DNA con estos ligandos es proporcional a la observada con PEG. En la condensación por neutralización la naturaleza del ligando también tiene un papel, que se manifiesta por la, en general, mayor intensidad del espectro y con la H1e que con la H1c, esta última con menor afinidad por el DNA. Las curvaturas estables, presentes en la SAR, ejercen un efecto desfavorable sobre la condensación. Este efecto desfavorable puede ser eliminado por la distamicina que estira el DNA. The histone H1 is necessary for the condensation of the chromatin and it can be implied in the activation and in the inhibition of specific genes. The histone H1 is coded by a multigenic family. In mammalians there are six somatic subtypes, H1a-e, H1º, a specific variant of the male germinal line, H1t, and a variant characteristic of the oocytes, H1oo. We have estimated the relative affinities of the six somatic subtypes, H1a-e and H1º, by the SAR cluster of the histones genes of Drosophila and for a fragment of pUC19 of similar length, by means of a competition assay between two subtypes present in similar concentration for a limited amount of DNA. The order of the affinities for the SAR fragment was H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), where the number within the parenthesis is the relative affinity expressed in relation to the subtype of weaker union, the H1a. The order of the affinities for the pUC19 fragment was H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). The relative affinities of the subtypes for the SAR and the pUC19 are similar. It is possible to distinguish three groups of affinities: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. Experiments of displacement of a subtype bound to the DNA for another subtype added later on, confirm qualitatively the order of affinities obtained from the equilibrium experiments. Competition experiments among the SAR and the pUC19 fragments for a limited amount of one of the subtypes of the H1 show that all the somatic subtypes, H1a-e and H1º, are SAR-binding proteins. The affinities of each of the subtypes for the DNA are determined at the same time by the characteristics of each subtype and of the sequences of DNA involved in the interaction. The exchange between the H1 of the native chromatin and an exogenous subtype, in presence of SAR to maintain the stechiometry of the H1 in the chromatin, has allowed to estimate the relative affinities of the subtypes H1a-e and H1º for the chromatin. The order of the affinities expressed in relation to the H1a was H1a (1. 0)<H1b (4. 1)<H1c (6. 2)<H1e (15. 3)<H1º (16. 6)<H1d (19. 0). The relative affinities are similar to those obtained for the DNA. Concerning the DNA, it is possible to distinguish three groups of affinity: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. The experiments of condensation of SAR, pUC19 and pBR322 fragments with PEG that condenses the DNA by volume exclusion, show that the structural and/or the mechanical stretching properties of each DNA determine widely the tendency to the ordered condensation that gives place to the y spectrum. The condensation by means of cationic ligands like the histones H1c and H1e, that neutralize the negative charge of the phosphates in the DNA backbone, confirm this conclusion, because the intensity of the y spectra obtained for the complexes of the different DNA fragments and the histones is proportional to the one observed with PEG. In the condensation by charge neutralization, the intrinsic properties of the histone also play an important role, explaining the greater intensity of the y spectrum with the H1e than the one obtained with the H1c, this last protein with lower affinity for the DNA. The sequence-induced DNA curvature, present in the SAR fragment, partially inhibits the induction of the y spectrum. This unfavourable effect can be suppressed by the distamycin that enlarges the DNA. |
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