Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/37795
Estudi del metabolisme central del carboni de Pichia pastoris / Aina Solà Rodrigo ; realitzada sota la direcció de Pau Ferrer i Alegre i Francesc Sánchez i Ferrando
Solà i Rodrigo, Aina
Ferrer i Alegre, Pau, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d’Enginyeria Química)
Sánchez-Ferrando, Francisco, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2006
Resum: Aquesta tesi s'emmarca en els àmbits la biologia de sistemes i l'enginyeria metabòlica, és a dir, en l'anàlisi quantitatiu de sistemes biològics complexes. En aquest estudi s'ha utilitzat el llevat metilotròfic Pichia pastoris com a organisme model, el qual ha adquirit durant els darrers anys una importància creixent en l'àmbit de la biotecnologia, mostrant una gran capacitat com a sistema de producció de proteïnes recombinants. L'objectiu principal de l'estudi ha estat establir tècniques i metodologies experimentals i computacionals d'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel•lular al sistema de P. pastoris. L'anàlisi quantitativa (i modelització matemàtica) dels processos cel•lulars és una eina molt valuosa per al redisseny racional del metabolisme cel•lular amb l'objectiu d'optimitzar els sistemes vius per a determinades aplicacions biotecnològiques (enginyeria metabòlica), així com per al disseny i optimització racional de processos de cultiu i expressió de proteïnes recombinants. Aquests objectius depenen de l'elucidació de la xarxa de bioreaccions, concretament de la recopilació de dades experimentals disponibles sobre els components de la xarxa, una estimació dels fluxos in vivo i la descripció teòrica (modelització) de la xarxa. Aquest treball ha estat centrat en l'estudi sistemàtic in vivo del metabolisme central del carboni de P. pastoris. El creixement del llevat sobre el sucre glucosa o d'altres compostos com la glicerina o metanol, substrats àmpliament utilitzats en processos de cultiu de P. pastoris, implica a un conjunt o xarxa de reaccions bioquímiques. La comparació de les variacions de fluxos metabòlics in vivo d'aquesta xarxa en cèl•lules de llevat creixent sota diferents condicions ambientals proporciona valuosa informació sobre el seu comportament i regulació. En aquesta tesi, s'han realitzat una sèrie de cultius en bioreactors operant en continu (quimiostat), els quals permeten mantenir les cèl•lules en condicions fisiològiques controlades i constants (estat metabòlic estacionari). Es varen realitzar estudis metabòlics de cèl•lules de llevat a diferents estats fisiològics, canviant el tipus de substrat disponible per a les cèl•lules o bé utilitzant barreges dels mateixos en diferents proporcions, i/o variant la velocitat específica de creixement cel•lular, per aleshores analitzar les variacions en la topologia de la xarxa metabòlica (rutes metabòliques actives) i les variacions en les fraccions de fluxos metabòlics. L'estimació de les variacions de fluxos metabòlics es realitzà experimentalment mitjançant tècniques de marcatge isotòpic dels substrats amb 13C, combinades amb tècniques de Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). En aquest treball, s'ha adaptat una metodologia prèviament desenvolupada per a l'anàlisi de metabolisme de bactèries, i posteriorment estesa a l'anàlisi d'organismes eucariotes utilitzant el llevat S. cerevisiae com a model. Aquesta metodologia permet determinar quines rutes metabòliques del metabolisme central del carboni estan actives i quantificar els fluxos de metabòlits a través d'aquestes. Els resultats obtinguts han mostrat en primer lloc que les rutes metabòliques per a la biosíntesi d'aminoàcids en Pichia pastoris són essencialment les mateixes que les descrites al llevat model Saccharomyces cerevisiae. A més, s'han detectat diferències significatives a nivell del cicle dels àcids tricarboxílics i de les reaccions anapleròtiques al comparar el creixement cel•lular a les diferents condicions del cultiu (diferents substrats i diferents velocitats específiques de creixement). Aquesta metodologia pot ser emprada en un futur de manera sistemàtica en l'estudi d'altres paràmetres clau dels processos de cultiu i producció de proteïnes recombinants en llevats com Pichia pastoris, tant genètics, com ambientals, així com la caracterització dels fluxos metabòlics per a estats d'estrès fisiològics de rellevància en el disseny del procés de cultiu/expressió.
Resum: The present thesis can be framed within the Systems Biology and Metabolic Engineering research areas, i. e. in the quantitative analysis of complex biological systems. The model biological system used in this work has been the methylotrophic yeast Pichia pastoris. This organism is becoming increasingly employed as a host system for the production of a wide variety of heterologous proteins. The quantitative analysis and the mathematic modelling of cellular processes has been shown to be a very valuable tool in the area of Biotechnology and Bioengineering, both for the rational design of cellular metabolism (metabolic engineering) and for the rational design and optimization of culture processes and expression of foreign proteins. The present work has been focused on the in vivo study of the Pichia pastoris' central carbon metabolism. Growth of this yeast on glucose and other carbon sources such as glycerol or methanol involves a network of biochemical reactions (metabolic pathways) that take place in the cytoplasm and/or in different subcellular compartments (organelles). The comparison between the in vivo variations of the topology (active metabolic pathways) and the in vivo variations of the metabolic fluxes (metabolic reaction rates) of this network under different environmental conditions and different genotypes, generate important information about its behaviour and regulation. In this work, a series of chemostat cultures have been performed at different growth conditions. Chemostat cultivations allow maintaining the cells at a controlled and constant physiological state (stationary metabolic state). In this way, it was possible to study different cellular metabolic steady states corresponding to different physiological states. These were achieved by growing cells under different environmental conditions, namely different carbon sources at growth rates. The measurement of the metabolic flux variations was done experimentally using isotopic tracer techniques involving substrates labelling with 13C, combined with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques. The methodology used in this study had been previously developed for the analysis of bacterial metabolism and subsequently extended to the analysis of eukaryotic organisms using Saccharomyces cerevisiae as a model. Such methodology has been adapted to P. pastoris cells growing on glycerol and/or methanol as carbon sources, thus allowing the identification of the active metabolic pathways of the central carbon metabolism of this organism and the quantification of the flux metabolites through them. The results obtained show, first of all, that the metabolic pathways for the amino acid biosynthesis in Pichia pastoris are essentially the same as the ones described for the model yeast S. cerevisiae. In addition, significant differences were detected at the level of the tricarboxylic acids cycle (TCA) and the anaplerotic reactions when comparing the cellular growth at different culture conditions (i. e. different carbon sources and different specific growth rates). The methodology employed in this work can be useful in the future for the systematic study of the influence of other key culture parameters (genetic or environmental) to the heterologous protein production with P. pastoris. It can also be useful for the characterization of the metabolic fluxes under different physiological stress states relevant for heterologous protein expression and overall process culture design.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Escola Tècnica Superior d'Enginyeries, Departament d'Enginyeria Química, 2004
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Ressonància magnètica nuclear ; Sistemes biològics ; Llevats ; Biotecnologia ; Saccharomyces
ISBN: 8468945951

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/5303


324 p, 3.5 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



   Favorit i Compartir