Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/37820
Estudi de la interpretació entre els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack / Sara Pagans i Lista
Pagans i Lista, Sara
Azorín Marín, Ferran, dir. (Institut de Biologia Molecular de Barcelona)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2003
Resum: Els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack (TTK) tenen en comú la presència d'un domini N-terminal de tipus POZ/BTB, un motiu estructural altament conservat present en factors de transcripció, proteïnes «kelch» i proteïnes de poxvirus que media interaccions proteïna-proteïna específiques. En algunes proteïnes, el domini POZ/BTB s'ha observat que participa en la formació d'homooligòmers i, basant-se en experiments de co-expressió in vitro, s'ha proposat que els dominis POZ/BTB també poden formar heterooligòmers. A més a més, en alguns factors de transcripció, el domini POZ/BTB s'ha demostrat que està involucrat en interaccions amb varis co-repressors i desacetilases d'histones. A la primera part d'aquest treball s'ha pogut demostrar que les isoformes GAGA519 i TTK69 interaccionen tant in vitro com in vivo, en llevats i en cèl. lules de Drosophila Schneider SL2, i que els seus dominis POZ/BTB són necessaris i suficients perquè aquesta interacció tingui lloc. Com molts promotors de Drosophila, la regió reguladora even-skipped (eve) stripe 2 conté alguns llocs d'unió per GAGA i TTK els quals estan relativament propers, suggerint que la interacció GAGA-TTK descrita podria participar en la seva regulació funcional. GAGA i TTK semblaria que tenen efectes oposats en la transcripció: l'expressió de molts gens de Drosophila està regulada positivament per GAGA i a més s'ha demostrat que GAGA actua com un activador transcripcional en condicions in vitro. Per altra banda, durant el desenvolupament embrionari primerenc, TTK actua com un repressor transcripcional d'alguns gens pair-rule, incloent-hi eve. Mitjançant experiments de transfecció transitòria en cèl. lules SL2 hem pogut demostrar que GAGA activa la transcripció del promotor eve stripe 2 i que TTK inhibeix aquesta activació mediada per GAGA. La repressió per TTK del promotor eve requereix de l'activació per GAGA i depèn de la presència d'ambdós dominis POZ de TTK i GAGA, suggerint que aquesta repressió és una conseqüència de la interacció GAGA-TTK. Interessantment, el domini POZ de TTK és capaç de reprimir per sí sol l'activació mediada per GAGA, mentre que la regió C-terminal de TTK, que conté la seqüència consens P-DLS d'unió al co-repressor dCtBP, no és necessària per una repressió eficient. Consistent amb això, la substitució del domini POZ de GAGA pel domini POZ de TTK aboleix per complet la capacitat transactivadora de GAGA i converteix la proteïna de fusió POZTTKDPOZGAGA en un repressor de l'activació de GAGA, un resultat que dóna suport a la consideració del domini POZ de TTK com un motiu repressor. Com els dominis POZ dels factors de transcripció PLZF i Bcl-6 reprimeixen la transcripció per un reclutament de desacetilases, es va testar aquesta possibilitat pel domini POZ de TTK. Per aquesta raó, es varen realitzar assajos transcripcionals a cèl. lules SL2 en presència de TSA, un inhibidor de les desacetilases de classe I i II. Els resultats obtinguts indiquen que la repressió de TTK sobre l'activació mediada per GAGA no involucra un reclutament de desacetilases al promotor, ja que la presència de TSA no té cap efecte sobre l'activitat de TTK. No obstant, no es pot descartar la possibilitat que la repressió per TTK pogués estar mediada per desacetilases insensibles a TSA. Utilitzant delecions del promotor eve stripe 2, s'ha observat que la repressió per TTK pot tenir lloc en absència de llocs d'unió per TTK al promotor, indicant que aquesta repressió no requereix unió directa de TTK al DNA. Amb aquesta observació ens vàrem plantejar si TTK pot interferir en la unió de GAGA al DNA, per la qual cosa vàrem realitzar assajos in vitro EMSA i de footprinting amb DNasa I utilitzant un fragment eve sense llocs d'unió per TTK emprant proteïnes recombinants GAGA i TTK. Els resultats obtinguts mostren que TTK no interfereix en la unió de GAGA al DNA. ; contràriament, els complexes GAGA-TTK semblen tenir una major afinitat d'unió al DNA. En resum, aquestes observacions suggereixen un model en el qual la repressió per TTK de l'activació mediada per GAGA implica una interacció directa GAGA-TTK la qual facilita el reclutament de TTK al promotor. No obstant, els nostres resultats no permeten diferenciar si la repressió per TTK és conseqüència d'una interferència en l'activació mediada per GAGA o a un reclutament actiu de co-repressors.
Resum: The Drosophila transcription factors GAGA and TTK share in common the presence of a N-terminal POZ/BTB-domain, a highly conserved structural motif present in transcription factors, kelch proteins and poxviruses proteins that mediates specific protein-protein interactions. In several proteins, the POZ/BTB-domain has been found to participate in the formation of homo-oligomers and, based on in vitro co-expression experiments, it has been proposed that POZ/BTB-domains can also form hetero-oligomers. In addition, in several transcription factors, the POZ/BTB-domain has been shown to be involved in interactions with various co-repressor proteins and HDACs. In the first part of this work, we have demonstrated that GAGA519 and TTK69 isoforms interact in vitro as well as in vivo, both in yeast and Schneider S2 cells, and that their POZ/BTB-domains are necessary and sufficient for this interaction to occur. As many Drosophila promoters, the even-skipped (eve) stripe 2 regulatory region contains several binding sites for GAGA and TTK which are in relatively close proximity, suggesting that the GAGA-TTK interaction described might participate in its functional regulation. GAGA and TTK appear to have opposite effects on transcription: the expression of many genes in Drosophila is positively regulated by GAGA and it has been shown that GAGA acts as a transcription activator in vitro. On the other hand, during early embryo development, TTK was shown to function as a transcription repressor of several pair-rule genes, including eve. Based on transient expression experiments in SL2 cells we have shown that GAGA activates transcription from the eve stripe 2 promoter and that TTK inhibits this GAGA-dependent activation. Repression by TTK of the eve promoter requires its activation by GAGA and depends on the presence of the POZ/BTB-domains of TTK and GAGA, suggesting that this repression is a consequence of GAGA-TTK interaction. Interestingly, the POZ domain of TTK appears to be able to repress GAGA-mediated activation, while the C-terminal region of TTK, that contains the P-DLS consensus sequence for dCtBP corepressor binding, is not necessary for an efficient repression. Consistent with this, the substitution of the POZ domain of GAGA by the POZ domain of TTK fully abolishes the transactivation activity of GAGA and converts the fusion protein POZTTKDPOZGAGA in a repressor of GAGA-activation. This result argues in favour of the repression activity of the POZ domain of TTK. As the POZ domains of PLZF and Bcl-6 transcription factors repress transcription by recruiting HDACs to the promoter, we tested this possibility for the POZ domain of TTK. For this reason, we have performed transfection assays in the presence of TSA, an inhibitor of HDACs class I and II. The results obtained indicated that TTK repression of GAGA-mediated activation doesn't involve recruitment of HDACs to the promoter, since the presence of TSA hasn't any effect in TTK activity. However, we can't discard the possibility that TTK repression should be mediated by HDACs insensitive to TSA. Using deletions of the eve stripe 2 promoter, we have observed that TTK repression could take place in the absence of TTK-binding sites in the promoter, indicating that TTK repression doesn't require direct binding of TTK to DNA. Then, we asked if TTK could interfere in GAGA-binding to DNA, so we performed in vitro EMSA and DNase I footprinting assays using an eve fragment without TTK binding sites and recombinant GAGA and TTK. The results obtained have shown that TTK doesn't interfere in the binding of GAGA to DNA. ; on the contrary, GAGA-TTK complexes appear to have a higher affinity to bind DNA. In summary, these observations suggest a model in which TTK repression of GAGA-mediated activation involves a direct interaction of GAGA and TTK that facilitates TTK recruitment to the promoter. However, our results don't allow to differentiate if TTK repression is a consequence of an interference of GAGA-dependent activation or an active recruitment of co-repressors.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2003
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Drosòfila ; Factors de transcripció
ISBN: 8468824976

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3483


184 p, 3.4 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



   Favorit i Compartir