Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/38091
Desenvolupament de proteïnes quimèriques multifuncionals com a vectors de transferència gènica mediada per receptor / Anna Arís i Giralt
Arís i Giralt, Anna (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia)
Villaverde Corrales, Antonio, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2004
Resum: Els últims avenços en biologia molecular i cel·lular no tan sols han contribuït al coneixement de la base molecular de moltes malalties, sinó que també han proporcionat una tecnologia amb potencial de manipulació de gens in vivo. La teràpia gènica sorgeix com una estratègia terapèutica basada en la transferència de material genètic per al tractament de malalties d'origen genètic o infecciós, substituint, reparant o potenciant la funció biològica dels teixits o sistemes lesionats. Els principals estudis en aquesta línia d'investigació estan dirigits al desenvolupament de vectors eficients en la transferència gènica. En els últims anys, l'ús de vectors no vírics en teràpia gènica ha anat prenent importància, ja que tot i que s'ha demostrat que els vectors vírics són eines molt eficients en la transferència de DNA, presenten limitacions associades, com ara la difícil obtenció de títols elevats de partícules víriques, la inducció de respostes immunològiques i riscs de seguretat biològica com la mutagènesi insercional i la possible reversió a vectors recombinants competents en replicació. És molt important assegurar dins del ús de sistemes no vírics, processos de transferència gènica mediada per receptor, no tan sols per dirigir el procés d'internalització cel·lular eficientment, sinó per poder mantenir l'especificitat per un tipus cel·lular diana. Les proteïnes quimèriques recombinants són candidats molt interessants en la transferència gènica no vírica. La generació d'aquests vehicles ha estat poc explorada dins la teràpia gènica, i es basa en la combinació de diverses proteïnes o dominis proteics bioactius en una sola cadena polipeptídica. Aquestes regions heteròlogues combinades, aporten capacitat d'unir molècules de DNA, el reconeixement i la internalització cel·lular i possibles funcions potenciadores de la transferència cel·lular com ara la llisi d'endosomes i el transport nuclear. Els senzills processos de producció i purificació a gran escala i la seva naturalesa modular, fan que siguin vehicles fàcilment optimitzables i adequables a noves aplicacions de teràpia gènica i amb un elevat potencial com a vectors alternatius als sistemes vírics. En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat un grup de proteïnes quimèriques prototip, basades en l'enzim b-galactosidasa d'Escherichia coli, que presenten en la seva superfície una cua de lisines com a domini d'unió a DNA i la regió de reconeixement cel·lular del virus de la febre aftosa basada en motius RGD. A més a més, l'enzim b-galactosidasa funciona com a domini de purificació del constructe resultant i permet detectar i quantificar les proteïnes quimèriques mitjançant assaigs colorimètrics senzills. La presència de forma natural en aquest enzim d'una seqüència de localització nuclear críptica permet a aquestes proteïnes dirigir eficientment la transferència de DNA en cèl·lules de mamífer. La primera construcció obtinguda va ser anomenada 249AL i es va demostrar que unia i condensava DNA eficientment i era capaç de dirigir específicament, mitjançant el reconeixement de la integrina avb3, la seva transferència en cultius cel·lulars. Després d'optimitzar el procés de transferència gènica in vitro es van realitzar aproximacions in vivo injectant complexes de proteïna-DNA intracerebralment en rates. Els resultats mostraven que la proteïna 249AL és un prototip de vector alternatiu al ús de vectors vírics en el SNC, especialment en aplicacions terapèutiques a zones lesionades en les que es produeix un increment de l'expressió dels gens de les integrines avb3. Derivats de la proteïna 249AL, com la proteïna NLSCt, demostren que mitjançant la incorporació de nous dominis com ara altres senyals de localització nuclear, com la del Antigen-T de SV40, és poden obtenir nivells d'expressió gènica més elevats. Aquests resultats conviden a aprofundir en l'aproximació modular al disseny de vectors recombinants no vírics per a teràpia gènica.
Resum: Recent advances in molecular and cellular biology have contributed to the knowledge of the molecular bases of some diseases and have provided new technologies for gene manipulation in vivo. Thus, gene therapy arises as a therapeutic strategy for gene delivery applied to the genetic and infectious diseases treatment, replacing, repairing or stimulating the biological function of affected tissues. The main studies in gene therapy have focused on the development of gene transfer vectors to ensure the efficiency in gene delivery processes. Some engineered viruses have been largely explored as such transfer vehicles with an important degree of success. However, a set of adverse reactions such as the difficult production of high viral particles titres, the induction of immune response and the associated biological risks such as insertional mutagenesis and the generation of replication competent viral particles, have strongly encouraged the use of non-viral vehicles for gene transfer. In the context of non-viral vectors, it is important to maintain receptor mediated gene transfer processes to ensure an efficient cellular internalisation and specificity. Chimerical recombinant proteins are interesting candidates in non-viral gene transfer and they have been constructed by combining bioactive proteins, or proteins domains, from different origins in a single polipeptidic chain. These joined regions supply DNA-condensing, cell-binding, internalisation and eventually endosome-disrupting and nuclear targeting activities. Although this family of constructs is still in an early stage of development, its intrinsic flexibility, the simplicity in the production and purification processes and the possibility of further improvement by protein engineering offers wider perspectives in gene therapy. In this Thesis it has been developed a new set of prototype chimerical proteins based on Escherichia coli b-galactosidase enzyme carrying a polylisine-based DNA binding domain and an integrin-targeting RGD cell binding peptide from Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The b-galactosidase acts as a purification domain of the final construct and permits its detection and quantification by simple colorimetric assays. The natural presence in this enzyme of a cryptic nuclear localisation signal (NLS) contributes to the efficiency of gene transfer to mammalian cells. The protein 249AL was the first construction obtained and it showed DNA binding and condensing abilities and led cellular gene transfer through the recognition of avb3 cellular integrins. After in vitro optimisation of gene delivery processes, in vivo approaches were carried out by injecting P9 rats intracerebrally with DNA-protein complexes. The results showed that 249AL protein is a promising alternative to viral vectors for CNS gene therapy, mainly in injured areas where the avb3 gene expression is increased. The 249AL derivatives, such as NLSCt protein, demonstrate that the incorporation of new functional domains such as other NLS, like that from SV40 T-antigen, could improve the obtained gene expression levels and invites explore in more detail this modular approach for the design of non-viral vectors in gene therapy.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament de Genètica i Microbiologia, 2003
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Beta galactosidasa ; Teràpia genètica ; Transformacions genètiques ; Proteïnes recombinants
ISBN: 8468833134

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3863


80 p, 2.3 MB

7 p, 301.5 KB

92 p, 938.7 KB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



   Favorit i Compartir