dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
(Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
| Imprint: |
Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2009 |
| Abstract: |
L'objectiu dels dos primers capítols va ser l'aplicació de la tècnica "Bimolecular fluorescent protein complementation" (BIFC) per a detectar interaccions intracel·lulars proteiques de caràcter dèbil in vivo. Durant l'estudi s'ha demostrat que es pot acoblar a la citometria de flux creant una eina d'anàlisi proteòmica. D'altra banda, també es demostra que l'emissió de fluorescència depèn de la força de la interacció. A més a més, el mètode BIFC pot ser aplicat per a obtenir informació sobre la superfície d'interacció. D'altra banda, es descriu l'ús de BIFC com a mètode per a detectar compostos que bloquegen la interacció de proteïnes diana in vivo. Es demostra que la inhibició de una interacció va unida a una disminució en la fluorescència detectada. En el tercer capítol, s'ha investigat el grau de co-agregació in vivo entre dues proteïnes amb tendència a agregar (el pèptid amiloide A42 i la proteïna VP1 que constitueix la càpside viral) co-expressades en E. coli. D'altra banda, l'estructura dels agregats intracel·lulars ha estat investigada per desxifrar si les fibres amiloides i els cossos d'inclusió comparteixen característiques estructurals. Les dades obtingudes indiquen que l'agregació proteica in vivo presenta una remarcable especificitat que depèn de l'establiment d'interaccions selectives i resulta en la formació d'estructures oligomèriques i fibrilars que presenten propietats amiloides En el quart capítol, es descriu un nou mètode per a estudiar l'agregació proteica en llevat. Es basa en la fusió de la proteïna d'interès a un enzim, concretament la di-hidrofolat reductasa (DHFR). L'activitat d'aquest enzim és essencial per al llevat. D'aquesta manera, sota la presència d'un inhibidor d'aquest enzim (anomenat metotrexat), la tendència a agregar de la proteïna diana queda directament lligada a la supervivència i creixement del llevat. En altres paraules, si la proteïna agrega, la DHFR no serà funcional i el llevat serà susceptible a la presència del metotrexat en el medi. Al contrari, si la proteïna no agrega, la DHFR es trobarà soluble en el medi intracel·lular conferint resistència al llevat. Degut al fet que l'agregació està relacionada al creixement, no es necessita cap assaig funcional per a detectar-la. A més a més, l'ús d'un derivat fluorescent del metotrexat permet confirmar l'estat d'agregació o solubilitat de la proteïna diana. D'altra banda, les propietats anti-agregacionals de diferents compostos químics que s'uneixen al pèptid A42 també varen ser avaluades emprant el mètode juntament amb l'efecte de la deleció o la sobre expressió de xaperones en l'agregació de A42. |
| Abstract: |
The aim of the two first chapters was to test the ability of Bimolecular Fluorescence complementation (BIFC) to detect in vivo weak intracellular protein interactions. In this technique, the binding partners are fused to two fragments of a fluorescent protein, which recovers its function upon binding of the interacting proteins. In addition, the application of BIFC was able to map the regions involved in a given interaction without need of previous structural knowledge of the binding mechanism. It was also proven that the fluorescence was dependent on the strength of the interaction, in such a way that it could be used, at least qualitatively, to screen for best binding candidates. This problem was solved with the coupling of BIFC to flow cytometry (FC) providing a highly sensitive method to validate weak protein interactions and to screen and identify optimal ligands in libraries. On the other hand, we studied the application of BIFC to the detection of antagonists of protein interactions in vivo turning the strength of the inhibition being linked to the fluorescence signal. In the third chapter, we investigated the degree of in vivo co-aggregation between two self-aggregating proteins co-expressed in E. coli: A42 amyloid peptide and foot-and-mouth disease virus VP1 capsid protein fused to fluorescent proteins. Our data demonstrated that, in vivo, different classes of proteins, which became associated in aggregates, exhibited distinct molecular interactions and did not necessarily co-aggregate. Also, the presence of abundant fibrillar structures with amyloid properties connecting apparently amorphous regions was observed Overall, this study suggested the existence of evolutionary conserved adaptations in living systems towards restricting non-specific aggregation of misfolded proteins. In the fourth chapter, a general method to assess the intracellular solubility of proteins in eukaryotic background (particularly in yeast) was developed. It consisted in the application of an "aggregation reporter", in which the test protein was expressed as N-terminal fusion with the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR). Due to the fact that the aggregation state of the fused protein was linked directly to yeast cells survival in the presence of methotrexate, protein solubility was monitored in vivo without the requirement of a functional assay for the target protein. In addition, the intracellular anti-aggregational properties of two chemical compounds that bind A peptide were also evaluated together with the effect of a series of knockouts of yeast chaperones as well as the impact of the over expression of their genes. |
| Note: |
Consultable des del TDX |
| Note: |
Títol obtingut de la portada digitalitzada |
| Note: |
Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2008 |
| Note: |
Bibliografia |
| Rights: |
ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.  |
| Language: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral |
| Subject: |
Cèl·lules ;
Agregació ;
Interaccions proteïna-proteïna ;
Fluorescència |
| ISBN: |
9788469198193 |
guest ::
(Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
