Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/55214
Development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli / memòria que presenta Jaume Pinsach i Boada ; [direcció: Josep López Santín i Carles de Mas Rocabayera]
Pinsach i Boada, Jaume
López Santín, Josep, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)
Mas i Rocabayera, Carles de, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2009
Resum: Aquest treball s'ha centrat en el desenvolupament del procés de producció d'aldolases recombinants en Escherichia coli. D'una banda, el procés de producció de fuculosa 1-fosfat aldolasa (FucA) recombinant va ser automatitzat utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor feble induïble per IPTG. Donat que la inducció en forma de pols no afectava de forma significativa el metabolisme cel·lular fins que s'havia assolit un alt rendiment de producte, es va implementar un control robust del procés mitjançant l'automatització d'alimentació exponencial de substrat. Es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular controlant la velocitat específica de creixement a nivells de substrat limitants. El llaç de control utilitzat es va basar en l'estimació indirecta de la biomassa (utilitzant l'anàlisi dels gasos de sortida) i balanços de matèria. D'altra banda, es va desenvolupar el procés de producció de ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) recombinant utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor fort induïble per IPTG. Estudis preliminars d'expressió obtinguts en cultius en erlenmeyer van indicar que l'ús d'un promotor fort presentava importants avantatges. En comparació amb el sistema d'expressió basat en un promotor feble, es van obtenir alts rendiments de producte en terminis més curts i amb menors requeriments d'inductor. No obstant això, el sistema va resultar ser extremadament sensible a la inducció en cultius d'alta densitat cel·lular. Per tant, es va prestar especial atenció al desenvolupament de les estratègies de procés més adients. En primer lloc, el desenvolupament del procés es va centrar en l'aplicació estratègies d'inducció alternatives en cultius d'alta densitat cel·lular. Tot i que en els estudis preliminars d'expressió s'havien aconseguit elevades activitats específiques, es van mesurar valors inferiors en cultius d'alta densitat cel·lular induïts amb polsos d'IPTG. Les condicions que provocaven un xoc metabòlic a les cèl·lules es van identificar i evitar mitjançant l'aplicació d'una estratègia d'addició contínua d'inductor. Aquesta estratègia va permetre la modulació de la velocitat d'expressió de la proteïna, de tal manera que la durada de la fase de producció es va estendre, els requeriments d'inductor van disminuir i es van assolir elevats rendiments de producte. Tot i això, els resultats encara indicaven una menor activitat específica de l'enzim que en el cas dels estudis preliminars d'expressió. Disminucions de l'activitat enzimàtica s'han atribuït sovint a l'estrès degut a un excés de temperatura (ja sigui traduït en un mal plegament de la proteïna i/o a proteòlisi en sí), de tal manera que es va dur a terme l'optimització de la temperatura del procés. En aquestes condicions es van mesurar velocitats de producció específiques més baixes, però es va aconseguir millorar significativament els rendiments de RhuA activa. També es van dur a terme estudis preliminars de modelització del procés. Tot i que no va ser possible calibrar un model de producció prou robust com per descriure totes les situacions que podrien ocórrer (i, per tant, l'optimització matemàtica de l'estratègia del procés no seria fiable), els estudis van permetre la identificació dels aspectes més importants del procés així com dels colls d'ampolla d'aquest. Aquesta informació va permetre desenvolupar una estratègia de creixement alternativa amb l'objectiu de reduir l'estrès cel·lular degut a la limitació de substrat. Mitjançant el control dels nivells de glucosa al bioreactor, es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular a nivells de substrat inhibitoris per evitar l'acumulació d'acetat. Després de l'optimització de l'estratègia d'inducció, es van obtenir alts rendiments de producte així com una elevada activitat específica de l'enzim. Finalment, es va realitzar un anàlisi global del procés de producció. Donat que l'objectiu era obtenir un enzim immobilitzat per ser utilitzat com biocatalitzador, les diferents estratègies de producció van ser comparades tenint en compte el seu impacte en les etapes posteriors de purificació i immobilització. Els resultats van mostrar que les estratègies alternatives de procés que s'havien desenvolupat en aquest treball augmentaven significativament els rendiments específics de RhuA immobilitzada activa respecte a l'anterior estratègia. Aquests resultats van posar de manifest la necessitat d'optimitzar la producció de proteïnes recombinants considerant tant el procés de producció com les fases posteriors de purificació i immobilització conjuntament.
Resum: This work has been focused on the development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli. On the one hand, the production process of recombinant fuculose 1-phosphate aldolase (FucA) was automated when using an expression system based on an inducible weak promoter. Since pulse induction did not significantly affect the host cell metabolism until high product yields were reached, a robust process control could be implemented by automating an exponential substrate feed. High cell density cultures were obtained at limiting substrate levels by controlling the specific growth rate. The implemented control algorithm used a simple feedback loop based on indirect biomass estimation (using exhaust gas analysis) and mass balances. On the other hand, the production process of recombinant rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) using an expression system based on an inducible strong promoter was developed. Results obtained from preliminary expression studies performed in shake flask cultures indicated that the use of a strong promoter presented important advantages. When compared to the expression system based on a weak promoter, high product yields were obtained in shorter times, and lower amounts of inducer were required. However, when going to high cell density cultures, the system was found to be extremely sensitive to induction. Thus, special attention was paid on the development of suitable process strategies. First, process development was focused on the implementation of alternative induction strategies in high cell density cultures. While high intracellular specific activities were achieved in shake flasks, lower specific values were measured in standard pulse-induced fed-batch cultures. The conditions under which high metabolic load on host cells compromised the productivity of the process were identified and avoided by implementing a continuous inducer addition strategy. When tuning protein expression rates, the length of the production phase was extended, the requirements of inducer were decreased and high product yields were achieved. However, results still showed lower specific enzyme activity than in the case of preliminary expression studies. Since decreased enzyme activity has been often attributed to temperature-driven stress (translated into either protein misfolding and/or proteolysis itself), optimisation of process temperature was carried out. Lower specific production rates were measured at a reduced process temperature, but significant improvement was achieved in terms of bioactive RhuA yields. Besides, preliminary studies on process modelling were carried out. Even though it was not possible to calibrate a production model robust enough to describe all situations which could potentially occur (and, thus, mathematical optimisation of the process strategy would not be reliable), insight of the process was gained, and some of the process bottlenecks and unknown key features were identified. From these learnings, an alternative growth strategy was then developed to minimise the starvation induced-stress on host cells. High cell density cultures were obtained at non-limiting substrate levels by controlling the glucose concentration in the culture at inhibiting values to avoid acetate accumulation. After optimising the induction strategy, high product yields as well as high specific enzyme activities were obtained. Finally, an analysis of the global production process was performed. Since the aim of the whole process was to obtain an immobilised enzyme ready to be used as biocatalyst, all different production strategies were compared taking into account their impact on downstream yields. When doing so, results showed that the alternative process strategies which had been developed in this work significantly increased the immobilised specific yields of active RhuA with respect to the previous strategy. These results reinforced the need to optimise recombinant protein production processes considering both the production and downstream stages as a whole.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Escola Tècnica Superior d'Enginyeria, Departament d'Enginyeria Química, 2009
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Aldolasa ; Cultiu cel·lular ; Enzims ; Biotecnologia
ISBN: 9788469248799

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/5325


182 p, 2.0 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2010-04-22, darrera modificació el 2016-04-15



   Favorit i Compartir