Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/55215
Estudi del mecanisme d'autoregulació del gen Trl i caracterització funcional a nivell global del factor GAGA en cèl·lules S2 de Drosophila melanogaster / David Piñeyro Valerio ; [sota la direcció del Dr. Jordi Bernués Martínez ; tutor: Jaume Farrés i Vicén]
Piñeyro Valerio, David
Bernués Martínez, Jordi, dir.

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2009
Resum: En aquest treball hem aprofundit en l'estudi del factor de transcripció GAGA de Drosophila melanogaster, codificat pel gen Trithorax-like (Trl). GAGA s'uneix al DNA per seqüències de tipus d(GA)n, presents a moltes regions reguladores. Ja inicialment es va comprovar que és un factor essencial, que activa multitud de gens. Tot i així, també s'ha vist que reprimeix l'expressió del gen que la codifica, Trl. En aquest treball hem fet especial èmfasi en l'estudi d'aquest mecanisme d'autoregulació negativa. A més, també hem realitzat un estudi funcional global de GAGA en cèl·lules, per tal d'identificar els processos en que hi podria participar. Per mitjà d'assajos a sistemes cel·lulars heteròlegs, hem conclòs que l'autoregulació negativa de Trl està conservada entre D. melanogaster i D. virilis, però no així a cèl·lules HeLa humanes, on lluny de reprimir, GAGA activa Trl. Partint de la idea de que ha d'existir algun element a la seqüència del promotor de Trl que determini aquesta autoregulació, hem buscat aquest element emprant diverses estratègies i metodologies. Tot i que no hem aconseguit definir exactament les regions imprescindibles per a la repressió, pels nostres resultats proposem que GAGA actuaria desplaçant a un activador més potent del promotor de Trl, resultant en una davallada de l'activitat transcripcional. Alternativament, també podria ser que existís algun factor repressor que actués juntament amb GAGA per a reprimir Trl. En aquest sentit, hem analitzat la contribució d'altres factors de transcripció al mecanisme de repressió. D'aquests, només dCtBP ha mostrat una certa activitat repressora de Trl, encara que probablement per un mecanisme independent de GAGA. D'altra banda, hem analitzat la contribució de les diferents regions de GAGA al mecanisme de repressió, determinant que el domini d'unió al DNA, tot i que imprescindible, no és suficient per a que es doni la repressió, ja que la correcta disposició nuclear i per tant, també l'activitat de GAGA, depenen en part de la regió X. Posteriorment, vàrem passar a validar els resultats en un sistema de mosques transgèniques, concloent que la repressió de Trl per GAGA es dóna igualment, de forma independent de teixit i d'estadi de desenvolupament. A més, emprant RT-PCR quantitativa hem demostrat que, tant a mosca com a cèl·lules, la sobreexpressió de GAGA es tradueix en una davallada dels mRNAs transcrits a partir de la còpia endògena de Trl, indicant que la repressió és molt probablement a nivell transcripcional. Finalment, hem realitzat un experiment de transcriptòmica global en funció de la sobreexpressió i depleció de GAGA via RNAi. Els resultats obtinguts indiquen clarament que GAGA és un activador en tots els casos excepte, potser, en uns pocs promotors en els que està per veure si ho fa directa o indirectament. A més, qualsevol sobreexpressió de GAGA és extraordinàriament letal per a la mosca, fet que justifica la rellevància de l'autoregulació de Trl in vivo. A més, hem vist que la sobreexpressió de la isoforma GAGA519 comporta una major letalitat que la de GAGA581, indicant un possible camí funcional diferent per a les dues isoformes.
Resum: In this work we have gone into the study of the Drosophila melanogaster's GAGA factor in depth. This factor is codified by the Trithorax-like (Trl) gene and it binds to d(GA)n DNA sequences, which are present in many regulatory regions. It is known that GAGA is an essential transcription factor that activates dozens of genes. In spite of this, it has been shown that GAGA factor can repress its own expression. In this work we have studied this negative self-regulation mechanism in detail. Moreover, with the aim to identify the processes in which GAGA factor can participate, a global functional analysis of GAGA in cells has also been performed. Taking advantage of working in heterologous cellular systems, we have concluded that the negative self-regulation of Trl is conserved between D. melanogaster and D. virilis, but not in HeLa human cells where on the contrary GAGA activates Trl. Assuming that it has to be some element in the Trl promoter sequence that should determine this negative regulation, we have made many efforts to find this element with different strategies and methodologies. Even though we have not been able to precisely define the essential regions for the repression, our results suggest that GAGA could be acting by displacing a stronger activator from the Trl promoter that leads to a decrease in transcriptional activation. On the other hand, it could be possible that a repressor factor could work with GAGA to repress Trl. In this direction, we have analyzed the possible contribution of different transcription factors in this repressing mechanism. Only dCtBP has shown some repressing activity but probably due to an independent mechanism not related to GAGA. Apart from that, we have also analyzed the contribution of the different domains of GAGA to the repressing mechanism, determining that the DNA binding domain is necessary but not sufficient to this repression, because the correct nuclear distribution and also the GAGA activity depend in part on the X region. Later on we validated the results in a transgenic fly system, concluding that Trl repression by GAGA exists and it is independent of the tissue and developmental stage. Furthermore, using quantitative RT-PCR we also demonstrate that both in flies and in cells, GAGA over-expression results in a depletion of the mRNA transcripts from the endogenous Trl copy, indicating that repression is probably taking place at transcriptional level. Finally, we have performed a high throughput transcriptome analysis, by over-expressing and also depleting GAGA factor, by using RNAi. The results obtained clearly indicate that GAGA is an activator except in few promoters in which it is still unclear whether it acts in a direct or indirect manner. Besides, any GAGA over-expression is extremely lethal for the fly, and that justifies the great importance of the self-regulation of Trl in vivo. We have also observed that over-expression of GAGA519 isoform results in more lethality than over-expression of GAGA581, indicating a differential way of function for the two isoforms.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Biociències, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2009
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Factors de transcripció ; Gens ; Regulació ; Proteïnes ; Transcripció genètica ; Drosòfila
ISBN: 9788469248737

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3600


252 p, 5.7 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2010-04-22, darrera modificació el 2016-04-15



   Favorit i Compartir