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Engineering and production of quality viral proteins in prokaryotic and eukaryotic systems / Mónica Martínez Alonso ; supervisors: Antonio Villaverde, Neus Ferrer, Rob Noad
Martínez Alonso, Mónica
Villaverde Corrales, Antonio, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia)
Ferrer Miralles, Neus, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia)
Noad, Rob, dir.
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia

Publicació: Bellaterra: Universitat Autònoma de Barcelona, 2010
Resum: La posibilidad de obtener proteínas con aplicaciones industriales o terapéuticas mediante la tecnología del DNA recombinante ha revolucionado la industria biotecnológica. A pesar de esto, la producción de proteínas recombinantes en sistemas heterólogos aún no está optimizada, y muchas veces estas proteínas se obtienen en forma insoluble. La selección de un sistema de expresión adecuado es importante para conseguir obtener la proteína en una forma funcional y soluble. En esta tesis se ha utilizado una GFP recombinante como proteína modelo para estudiar agregación y actividad durante la producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli y en el sistema de expresión de baculovirus. Al producir nuestra proteína modelo en E. coli, ésta se obtiene mayoritariamente en forma de cuerpos de inclusión con una elevada actividad biológica. Nuestros resultados indican que aunque es posible mejorar la solubilidad de la proteína optimizando parámetros del proceso de producción, las condiciones que permiten mejorar los niveles de producción resultan en una disminución de la calidad conformacional de la proteína obtenida. Ya que no es posible maximizar al mismo tiempo el rendimiento del proceso de producción y la calidad de la proteína obtenida, el diseño del proceso deberá optimizarse en función del parámetro más relevante para el uso final de la proteína. Además, la versión soluble de esta proteína contiene una amplia gama de agregados solubles, que conforman una población heterogénea en cuanto a estructura secundaria y funcionalidad. Esto indica que los cuerpos de inclusión, que son más homogéneos que su versión soluble, pueden entenderse como una pequeña subpoblación dentro del total de especies proteicas recombinantes. Por otra parte, la calidad de la proteína recombinante representa un promedio estadístico de la calidad de cada una de estas especies. Una de las estrategias más utilizadas para mejorar la solubilidad de proteínas recombinantes consiste en la coexpresión de moduladores del plegamiento. Al coexpresar la chaperona bacteriana DnaK y su cochaperona DnaJ con nuestra GFP modelo producida en E. coli, observamos una disminución de la agregación, que estaba asociada a proteólisis. El cambio de huésped de estas chaperonas juntamente con nuestra proteína modelo para producirlas en el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto o larvas permitió mantener la actividad foldasa de DnaKJ eliminando su actividad proteolítica asociada, ya que ésta es dependiente de proteasas bacterianas. En el sistema de expresión de baculovirus observamos mejoras en los niveles de proteína total y soluble, la estabilidad proteolítica, solubilidad y actividad biológica al ser coexpresada con las chaperonas bacterianas DnaKJ. Además, hemos podido confirmar en un sistema eucariota el concepto de que el rendimiento y la calidad de la proteína obtenida son parámetros antagónicos que no se pueden favorecer de forma simultánea en procesos de producción. Por último, también hemos podido comprobar que las chaperonas bacterianas son funcionales en un sistema eucariota. Esto permite ampliar el catálogo de moduladores del plegamiento disponibles para su uso en sistemas eucariotas.
Resum: Recombinant DNA technology boosted the production of recombinant proteins with industrial or therapeutic applications, which transformed biotechnological industry. Despite this, recombinant protein production in heterologous systems is not yet optimized, and these proteins are often obtained as insoluble deposits. Choice of an appropriate expression system is important for proteins to be produced in a soluble and functional form. In this thesis, a recombinant GFP has been used as a model protein to study aggregation and biological activity during recombinant protein production in Escherichia coli and the baculovirus expression system. In E. coli, our model protein is obtained mainly as highly active inclusion bodies. Our results show that although protein solubility can be enhanced by optimizing several parameters in the production process, conditions promoting high production levels result in decreased conformational quality of the protein. Since it is not possible to enhance simultaneously production yield and quality, process design should be optimized depending on the most relevant feature for the final use of the protein. Moreover, the soluble version of this protein contains a wide range of soluble aggregates, which constitute a heterogeneous population regarding secondary structure and functionality of the protein. This indicates that inclusion bodies, being more homogeneous than their soluble counterparts, can be regarded as a narrow subpopulation among all the recombinant protein species. Moreover, the quality of the recombinant protein represents a statistical average of the quality of each of these species. One of the most widely used strategies to improve solubility of recombinant proteins consists of coexpressing folding modulators. When the bacterial chaperone pair DnaK/DnaJ was coexpressed in E. coli together with our model GFP, we observed a decrease in aggregation, which was associated to proteolysis. Rehosting of these chaperones, together with our model protein, to the baculovirus expression system (using either cultured insect cells or larvae as hosts) allowed us to maintain the foldase activity of DnaKJ while avoiding their associated proteolytic activity, as it is dependent on bacterial proteases. By using the baculovirus expression system, we observed enhanced production levels (both total and soluble), proteolytic stability, solubility and biological activity of our recombinant protein when it was coexpressed with bacterial chaperones DnaKJ. Furthermore, the concept that yield and quality of the recombinant protein are antagonistic parameters that cannot be favored simultaneously in production processes has been proven in a eukaryotic system. Finally, we have also demonstrated that bacterial chaperones are functional in a eukaryotic system. This expands the catalogue of folding modulators available for eukaryotic systems.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Biociències, Departament de Genètica i de Microbiologia, 2010
Nota: Descripció del recurs: el 1 de febrer de 2011
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Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Biotecnologia ; Proteïnes recombinants ; Cèl·lules ; Agregació
ISBN: 978-84-693-2035-8

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3937


98 p, 4.4 MB

95 p, 5.5 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2011-03-07, darrera modificació el 2016-04-15



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