Revista de la Societat Catalana de Química, núm. 21 (2022), p. 88-98 ISSN: 2013-9853 DOI: 10.2436/20.2003.01.139 Filial de l’Institut d’Estudis Catalans http://revistes.iec.cat/index.php/RSCQ Preparació de blocs quirals per a nous agents de penetració cel·lular Preparation of building blocks for new cell-penetrating agents Víctor Maestre,1 Ona Illa,1 Miriam Royo2 i Rosa M. Ortuño1 1 Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Ciències. Departament de Química 2 Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) Resum: Les membranes plasmàtiques protegeixen la cèl·lula d’invasions exògenes, fet que dificulta l’arribada de certs fàrmacs a les seves dianes terapèutiques intracel·lulars. En els últims anys, s’han desenvolupat diferents pèptids sintètics per internalitzar diferents molècules bioactives. Aquest article tracta de la síntesi en fase sòlida de dos pèptids tetradecamèrics híbrids mitjançant l’estratègia Fmoc/Boc. Aquests pèptids estan constituïts per un g-aminoàcid ciclobutànic i un residu de trans-g-amino-l-prolina funcionalitzat, en- llaçats alternadament. Alguns d’aquests pèptids han donat bons resultats d’internalització en cèl·lules HeLa i en el paràsit leish­ mània, i es preveu realitzar un estudi en profunditat de les seves propietats de penetració. Paraules clau: Pèptids de penetració cel·lular, internalització cel·lular, aminoàcid ciclobutànic, trans-g-amino-l-prolina, síntesi en fase sòlida, leishmània. Abstract: Plasma membranes protect the cell from exogenous invasions and this may impede the arrival of some drugs to their intracellular therapeutic target. In recent years, various synthetic cell-penetrating peptides have been developed which permit the internalization of different bioactive molecules. This paper deals with the solid-phase synthesis of two hybrid tetradecameric peptides using the Fmoc/Boc strategy. These pep- tides consist of a g-cyclobutane amino acid that is alternately linked with a functionalized residue of trans-g-amino-l-proline. Some of these peptides have provided good results in internalizing HeLa cells and Leishmania parasites, and their internaliza- tion properties will continue to be studied. Keywords: Cell-penetrating peptides, cellular internalization, cyclobutane amino acid, trans-g-amino-l-proline, solid-phase synthesis, Leishmania. Introducció L ing peptides) que han contribuït significativament a l’avenç científic en aquesta àrea. es membranes plasmàtiques tenen un paper molt important com a barreres bioquímiques efectives en la resistència envers la invasió exògena [1]. Pèptids de penetració cel·lular (CPP) Generalment, estan formades per una bicapa lipí- dica que conté múltiples lípids químicament di- Generalment, els CPP són pèptids curts carregats positiva- ferents, presents en diverses quantitats i propor- ment i constituïts per residus bàsics que consten d’entre cinc i cions [2]. Per als fàrmacs basats en molècules trenta aminoàcids. Aquests pèptids presenten una baixa cito- petites, travessar aquesta membrana pot implicar un procés toxicitat i són capaços de realitzar la transducció de membra- cel·lular natural com la difusió directa a través de la bicapa na a baixes concentracions, tant in vivo com in vitro, sense lipídica. No obstant, hi ha molècules de pes molecular més provocar danys importants a la membrana [4]. A més, es po- gran, hidrofòbiques, hidròfiles o carregades que necessiten den modificar fàcilment durant el seu disseny, fet que els ajuda per ser transportades a l’interior de la cèl·lula [3]. converteix en un dels sistemes de lliurament cel·lular més in- teressants per ser estudiats en aplicacions farmacològiques. En les últimes dècades, s’han desenvolupat diversos pèptids sintètics de penetració cel·lular (CPP, de l’anglès cell penetrat­ D’altra banda, els CPP es poden unir de forma covalent o no covalent a un ampli ventall de molècules de càrrega, com al- tres pèptids, proteïnes, àcids nucleics, oligonucleòtids, liposo- Correspondència: Ona Illa Soler Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Ciències. Departament de Química mes, plasmidis, fàrmacs o altres nanopartícules [5], la qual 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès cosa en fa possible el transport i l’alliberació a l’interior de 88 Tel.: +34 935 814 884 A/e: ona.illa@uab.cat la cèl·lula. Figura 1. Monòmers utilitzats en CPP sintetitzats en el grup de recerca SERQ. Elaboració pròpia. Per disposar d’un CPP amb una bona internalització cel·lular aquests pèptids van ser sintetitzats en forma d’hexapèptids i cal una combinació òptima d’hidrofobicitat/hidrofília i tenir es va estudiar la influència de la configuració absoluta dels presents funcionalitzacions que augmentin la capacitat d’in- aminoàcids ciclobutànics, així com la influència dels substi- teracció amb la membrana plasmàtica. En aquest sentit, els tuents en la posició N a, la g-aminoprolina en l’estructura del CPP rics en derivats de prolina presenten una bona solubilitat pèptid i en la seva capacitat d’internalització en cèl·lules HeLa en aigua i poden ser substituïts en la posició N a de l’anell de [6-8]. Més recentment, s’han preparat pèptids de més llarga- pirrolidina amb el fi de modular les seves propietats hidrofò- da, fins a tetradecapèptids, que han estat estudiats com a biques o hidrofíliques. Per la seva banda, els CPP rics en argi- agents de penetració cel·lular amb cèl·lules HeLa i amb leish- nina i grups guanidini presenten una bona internalització grà- mànies, i que han mostrat un comportament notable no només cies al fet que es troben protonats a pH fisiològics i poden en la transducció cel·lular, sinó com a agents leishmanicides. interaccionar amb grups aniònics de la superfície cel·lular. A aquests pèptids s’hi ha conjugat una molècula d’un fluorò- for, la carboxifluoresceïna (CF), així com el fàrmac doxorubicina (Dox), un agent antiparasitari contra leishmània i que també Estudis precedents és utilitzat en la teràpia contra el càncer [9, 10]. En aquests estudis es va confirmar que els CPP basats en g-CBAA propor- En els darrers anys, el grup de recerca Síntesi, Estructura i cionen millors resultats en termes d’internalització que els Reactivitat Química (SERQ), del Departament de Química de basats en b-CBAA. Cal destacar també que la presència la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), ha desenvolupat d’aminoàcids no naturals i amb restriccions conformacionals diversos CPP híbrids basats en una combinació alternada de en els CPP (com és el cas de l’ús dels aminoàcids ciclobutànics diferents b-aminoàcids ciclobutànics (CBAA) o g-CBAA, res- que es presenten en aquest treball) s’ha descrit com un aspec- pectivament, amb residus de cis- o trans-g-amino-l-prolina, te positiu per assolir millors nivells de resistència a la proteò- entre d’altres (vegeu la figura 1). En un primer moment, lisi i menys toxicitat [11]. 89 Esquema 1. Proposta retrosintètica per a l’obtenció dels pèptids híbrids g-CBAA/g-amino-l-prolina. Elaboració pròpia. Actualment, hi ha pocs exemples de CPP que puguin ser inter- respectiu èster tert-butílic 8. Posteriorment, es realitza una nalitzats pel paràsit leishmània, la qual cosa fa que aquest transformació de la metilcetona en el corresponent àcid car- camp de recerca sigui d’interès [12]. L’objectiu d’aquest treball boxílic mitjançant una reacció de l’haloform (o Lieben) i s’ob- ha estat sintetitzar pèptids híbrids g-CBAA/g-amino-­l-prolina té l’hemièster 9. A continuació, es realitza una transposició de per portar a terme nous estudis biològics (vegeu l’esquema 1). Curtius per tal de transformar el grup carboxil, a través d’un isocianat, en una amina protegida per un grup benziloxicar- bonil (Cbz). La transformació anterior és el pas clau per a la Resultats i discussió síntesi del monòmer 3, no només perquè el seu rendiment és lleugerament més baix que la resta d’etapes sinó perquè per- Síntesi del monòmer γ-CBAA 3 metrà la posterior protecció del grup amina en forma de Fmoc, necessària per a l’estratègia utilitzada en la síntesi en Tenint en compte que els pèptids híbrids g-CBAA/g-amino-­l- fase sòlida. Una vegada s’ha obtingut el carbamat 10, protegit prolina se sintetitzen en fase sòlida utilitzant l’estratègia ortogonalment, es realitza una hidrogenació catalítica del Fmoc/Boc, va ser necessari protegir adequadament l’extrem carbamat de benzil que dona com a resultat l’amina lliure 11, N-terminal del g-CBAA 3 amb el grup fluorenilmetiloxicarbo- la qual es protegeix amb el grup protector Fmoc. Finalment, es nil (Fmoc), el qual presenta una alta estabilitat en presència procedeix a l’eliminació selectiva de l’èster tert-butílic per ob- d’agents àcids però pot ser eliminat fàcilment en certes con- tenir el γ-CBAA 3. dicions bàsiques. El nostre grup de recerca (SERQ) ha descrit una seqüència de Síntesi de la cadena lateral 4 set passos per a la preparació del g-CBAA 3 [7]. La ruta sintè- tica es mostra a l’esquema 2. Tal com s’explica a la introducció, la presència d’un grup gua- nidini en les cadenes laterals del pèptid afavoreix el procés Partint de la (–)–verbenona 6, comercialment disponible, d’internalització cel·lular. Per tal d’introduir el grup guanidini l’anell de sis membres s’obre mitjançant un trencament oxi- a l’aminoàcid 13 s’utilitza l’agent guanidilant 14 i així es por- datiu del doble enllaç C—C, que, gràcies a una posterior des- ta a terme una reacció que té lloc per mitjà d’un mecanisme carboxilació a-carbonílica, esdevé l’àcid carboxílic 7. Alesho- d’addició-eliminació en presència de N,N’-diisopropiletilamina res, es realitza una protecció de l’àcid carboxílic que dona el (DIPEA) com a base (vegeu l’esquema 3). 90 Esquema 2. Ruta sintètica per a la preparació del monòmer 3 a partir de la (-)-verbenona 6. Elaboració pròpia. Esquema 3. Síntesi de la cadena lateral 4. Elaboració pròpia. L’agent guanidilant 14 es troba protegit amb dos grups l’èster benzílic, ja que aquest és ortogonal respecte als altres tert-butoxicarbonil (Boc) com a grups protectors permanents, dos grups protectors mencionats, és a dir, presenta condicions necessaris per a l’estratègia utilitzada en la posterior síntesi de desprotecció diferents de les dels altres. Seguidament, es en fase sòlida dels pèptids. realitza una desprotecció de la posició N a de l’anell de pirroli- dina en condicions àcides i s’obté la sal d’amoni 16. Síntesi de la trans-γ-amino-l-prolina A continuació, es prepara l’aminoàcid 17 per mitjà de l’aco- blament de la cadena lateral 4 amb la sal d’amoni 16 (vegeu modificada 18 l’esquema 5). La síntesi de la trans-γ-amino-l-prolina modificada 18 es porta a terme seguint una seqüència sintètica de quatre eta- Per portar a terme aquesta reacció, la cadena lateral 4 es pes, representades als esquemes 4 i 5. El primer pas necessari mescla prèviament amb DIPEA i amb hexafluorofosfat de en aquesta síntesi és la protecció del grup carboxil del derivat (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfoni (PyBOP) per tal de g-amino-l-prolina 5, per posteriorment poder realitzar una d’activar l’àcid carboxílic, que, una vegada activat, s’afegeix reacció d’acoblament entre la sal d’amoni 16 i la cadena late- sobre una solució de la sal d’amoni 16. Després de purificar ral 4. En el cas que no es realitzés aquesta protecció podria 17 per mitjà d’una columna cromatogràfica de gel de sílice, el haver-hi problemes de competitivitat entre l’amina i el car- rendiment mitjà obtingut per aquesta reacció és d’un 45 %, boxilat del derivat de prolina en l’atac nucleòfil sobre el grup un valor més baix que el de les altres etapes d’aquesta síntesi. carboxil, activat amb un agent d’acoblament, de la cadena la- El fet que es recuperi una quantitat significativa de la cadena teral 4. Degut a la presència de grups Fmoc i Boc a l’aminoà- lateral 4 i de la sal d’amoni 16 després de la cromatografia en cid 5, el grup protector escollit per protegir l’àcid carboxílic és columna, significa que aquest baix rendiment podria ser Esquema 4. Etapes 1 i 2 de la ruta sintètica per a la preparació de la sal d’amoni 16. Elaboració pròpia. 91 Esquema 5. Etapes 3 i 4 de la ruta sintètica per a la preparació de l’aminoàcid 18. Elaboració pròpia. degut a una baixa conversió i no a altres reaccions secundà- Síntesi en fase sòlida dels pèptids (SFS) ries que poguessin haver tingut lloc. Com s’ha esmentat anteriorment, els pèptids híbrids γ-­CBAA/ Finalment, una vegada obtingut l’aminoàcid 17 es realitza γ-amino-l-prolina 1 i 2 (vegeu l’esquema 2) se sintetitzen una hidrogenació a una pressió d’un bar utilitzant Pd/C utilitzant tècniques de síntesi en fase sòlida mitjançant l’es- catalític per tal de desprotegir l’èster benzílic i s’obté la tratègia Fmoc/Boc. El procediment per a la preparació dels trans-γ-amino-l-prolina 18 (vegeu l’esquema 5). pèptids desitjats es mostra a l’esquema 6. * En la repetició dels sis cicles no es té en compte l’última desprotecció. 92 Esquema 6. Procediment general seguit en SFS. Elaboració pròpia. El primer pas de la síntesi en fase sòlida consisteix en l’aco- dica fins a assolir la longitud de catorze unitats (tetradecà- blament dels grups amino de la resina seleccionada amb el mer). Per assegurar el correcte acoblament dels aminoàcids, grup carboxil de la trans-γ-amino-l-prolina modificada 18. cada cinc acoblaments es realitza una miniruptura del pèptid Inicialment, la síntesi peptídica es va portar a terme utilitzant de la resina. Per fer-ho, es pren una petita quantitat de resina 500 mg de resina H-Rink amide ChemMatrix® considerant i es tracta amb àcid trifluoroacètic (TFA), triisopropilsilà (TIS) i una funcionalització de 0,3 mmol/g de grups amino lliures. El aigua per tal de separar el pèptid de la resina i desprotegir primer acoblament de la síntesi es va realitzar utilitzant un tots els grups protectors de la cadena lateral. Aquestes mos- equivalent de la trans-γ-amino-l-prolina modificada 18, tres s’analitzen per cromatografia líquida d’alta resolució aco- un equivalent de PyBOP com a agent d’acoblament, un equi- blada a espectrometria de masses (HPLC-MS, de l’anglès high valent de 2-ciano-2-(hidroxiimino)acetat d’etil (Oxyma Pure®) performance líquid chromatography - mass spectrometry). com a additiu i dos equivalents de DIPEA com a base. Després de realitzar el primer acoblament, el test de ninhidrina [13] va Un cop sintetitzat adequadament el tetradecàmer, la resina revelar que la major part dels grups amino de la resina no ha- es divideix en dues parts per tal de fer seguir a cada part una vien estat funcionalitzats per aminoàcids (denotat per un co- ruta diferent. Una part de la resina amb la cadena peptídica lor blau molt intens). En aquest sentit, es va realitzar un ancorada 2 es va retirar amb l’objectiu d’acoblar-hi, en un fu- reacoblament utilitzant les mateixes condicions i proporcions tur, diferents marcadors i fàrmacs per continuar l’estudi biolò- que en el primer acoblament, però el test de ninhidrina va gic que s’està portant a terme en el grup de recerca. La resina continuar revelant una baixa funcionalització d’aminoàcids. restant va ser utilitzada per incorporar la 5(6)-carboxifluores- ceïna (CF) a l’extrem N-terminal del pèptid. Aquesta s’acobla En conseqüència, es va augmentar la relació d’aminoàcid per abans de separar el pèptid de la resina utilitzant PyBOP com a grup amino de la resina i es va substituir el PyBOP per un altre agent d’acoblament, Oxyma Pure® com a additiu i DIPEA com agent d’acoblament, en aquest cas una carbodiimida. Seguint a base. Després de realitzar l’acoblament de la CF, es va obser- aquesta idea, es van fer servir 360 mg de la resina anterior con- var una coloració vermellosa del medi de reacció. Aquesta co- siderant una funcionalització de 0,5 mmol/g i el primer acobla- loració és resultat de la formació de dímers de carboxifluores- ment es va realitzar utilitzant N,N’-diisopropilcarbodiimida ceïna (vegeu la figura 2). Anteriors estudis han demostrat que (DIC) com a agent d’acoblament i Oxyma Pure® com a additiu. l’hidroxil fenòlic de la carboxifluoresceïna pot ser acilat degut Aquesta vegada, una vegada eliminat el Fmoc de l’extrem a l’autoactivació del grup carboxil de la CF, que dona lloc a la N-terminal, el test de ninhidrina va demostrar un alt percentat- formació in situ d’un èster fenòlic [14]. A més, els èsters fenò- ge de funcionalització de la resina amb l’aminoàcid 18 afegit. lics, en particular els èsters fenòlics amb grups electroa- traients, són ben coneguts pel fet de ser hidrolitzats per nu- Una vegada la γ-amino-l-prolina modificada 18 està ancora- cleòfils i medi bàsic. D’acord amb aquesta idea, es va portar a da a la resina, es continua amb l’elongació del pèptid per mit- terme un tractament amb piperidina en N,N-dimetilformamida jà de l’acoblament del γ-CBAA N-protegit 3 utilitzant PyBOP (DMF) (4:6, v/v) que va permetre eliminar fàcilment aquests com a agent d’acoblament, Oxyma Pure® com a additiu i productes secundaris i obtenir-ne el pèptid marcat amb CF. DIPEA com a base. Aquest procés es repeteix diverses vegades, L’eliminació de l’èster fenòlic va poder ser observada d’acord intercalant els monòmers 3 i 18 per allargar la cadena peptí- amb la desaparició del color vermellós del medi de reacció. 93 Figura 2. Dímer de carboxifluoresceïna. Elaboració pròpia. Finalment, la separació del pèptid de la resina es va portar a DMF (12 mL). La mescla de reacció s’agita a temperatura terme per mitjà d’una hidròlisi àcida utilitzant una mescla de ambient durant 48 h. Es realitzen extraccions amb acetat TFA/TIS/H2O, metodologia amb la qual les proteccions dels d’etil (4 × 20 mL) i rentats de la fase orgànica amb salmorra grups guanidini amb carbamats de tert-butil també són elimi- (2 × 15 mL). S’asseca el conjunt de fases orgàniques amb nades. MgSO4 anhidre i s’evapora el dissolvent a pressió reduïda. Es liofilitza el producte per tal d’eliminar la màxima quantitat de DMF possible. S’obté l’aminoàcid 15 com un sòlid blanc de Part experimental forma quantitativa sense necessitat d’etapa de purificació. 1 H-RMN (250 MHz, CDCl3): d 8,04 (s, 1H), 7,78 (d, J = 7,5 Hz, Preparació del γ-CBAA 3 2H), 7,59 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,37 (m, 9H), 5,18 (m, 2H), 4,84 (m, 1H), 4,46 (m, 2H), 4,27 (m, 2H), 3,77 (m, 1H), 3,39 (m, 1H), La preparació del g-CBAA 3 es porta a terme seguint la se- 2,23 (m, 1H), 1,42 (m, 9H) ppm. qüència sintètica descrita pel nostre grup de recerca [7]. Síntesi de trifluoroacetat de (2S,4R)-4-((9H-fluoren-9-il) metoxicarbonilamino)-2-benziloxicarbonilpirrolidin-1-i 16 Preparació de la cadena lateral 4 A una solució agitada de l’aminoàcid 15 (0,66 g, 1,2 mmol) en Síntesi de l’àcid 5-(3-(tert-butoxicarbonil)guanidino) CH2Cl2 (5,3 mL) s’afegeix àcid trifluoroacètic (3,3 mL). S’agita pentanoic 4 la reacció a temperatura ambient durant 1 h. Es realitzen co­evaporacions amb 2 × 10 mL de CH2Cl2 i 3 × 10 mL de Et2O Es dissol l’àcid 5-aminopentanoic 13 (0,60 g, 5,1 mmol) en per eliminar el dissolvent i l’excés de volàtils. La sal d’amoni 60 mL d’una mescla CH3CN/H2O (55:5, v/v). S’afegeix DIPEA 16 (0,660 g, 1,19 mmol, rendiment quantitatiu) s’obté com un (2,6 mL, 14 mmol) i es refreda la solució a 0 °C. A continuació, sòlid blanc sense necessitat d’etapa de purificació. 1H-RMN s’addiciona N,N’-bis(tert-butoxicarbonil)-1H-pirazol-1-­ (360 MHz, MeOD): d 7,99 (s, 1H), 7,80 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 7,64 carboxamidina 14 (1,75 g, 5,64 mmol) i la mescla de reacció (d, J = 7,5 Hz, 3H), 7,36 (m, 9H), 5,33 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 5,29 s’agita a temperatura ambient durant 16 h. S’evapora el dis- (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,55 (m, 3H), 4,23 (m, 2H), 3,56 (m, 1H), solvent a pressió reduïda, el cru es dissol en acetat d’etil 3,36 (m, 1H), 2,38 (m, 2H) ppm. 13C-RMN (90 MHz, MeOD): d (30 mL) i aigua (10 mL) i s’ajusta a pH 2-3 utilitzant HCl 1 M. 168,1, 163,5, 143,8, 141,3, 134,9, 128,5, 128,4, 128,3, 127,4, Es realitzen rentats amb salmorra (2 × 10 mL), la fase orgàni- 126,8, 124,6, 119,6, 117,7, 68,3, 66,2, 58,5, 50,3, 49,9, 47,9, ca s’asseca amb MgSO4 anhidre i el dissolvent s’evapora a 47,0, 33,6 ppm. pressió reduïda. S’obté la cadena lateral 4 (1,70 g, 4,73 mmol, 92 % de rendiment) com un sòlid blanc. 1H-RMN (360 MHz, Síntesi de (2S,4R)-4-((9H-fluoren-9-il)metoxicarbonil­ CDCl3): d 11,27 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 3,41 (m, 2H), 2,37 (m, 2H), amino)-1-(5-(2,3-bis(tert-butoxicarbonil)guanidino) 1,68 (m, 4H), 1,47 (s, 18H) ppm. pentanoil)pirrolidina-2-carboxilat de benzil 17 S’afegeix PyBOP (1,11 mmol) i DIPEA (4,44 mmol) a una solu- Preparació de la trans-γ-amino-l-prolina ció agitada de la cadena lateral 4 (0,400 g, 1,11 mmol) en modificada 18 DMF anhidra (3 mL), prèviament purgada amb nitrogen. Es manté en agitació a temperatura ambient durant 30 minuts Síntesi de (2S,4R)-4-((9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino) per tal d’activar l’àcid. Una vegada l’àcid ha sigut activat cor- pirrolidina-1,2-di-carboxilat de 2-benzil 1-(tert-butil) 15 rectament, s’afegeix sobre una solució de la sal d’amoni 16 (0,615 g, 1,11 mmol) en DMF anhidra (5 mL), prèviament pur- S’afegeix bromur de benzil (150 μL, 1,26 mmol) i NaHCO3 gada amb nitrogen. La mescla de reacció s’agita a temperatu- (0,118 g, 1,40 mmol) a una solució agitada de l’àcid ra ambient durant 16 h. Es realitzen extraccions amb acetat (2S,4R)-4-((9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino)-1-(tert-­ d’etil (25 mL) i aigua (25 mL), s’asseca la fase orgànica amb 94 butoxicarbonil)pirrolidin-2-carboxílic 5 (0,50 g, 1,1 mmol) en MgSO4 anhidre i s’evapora el dissolvent a pressió reduïda. Es purifica el producte per cromatografia en columna utilitzant S’ha utilitzat la resina H-Rink amide ChemMatrix® amb una com a eluent una mescla d’acetat d’etil / hexà 3:1. S’obté funcionalització de 0,5 mmol/g, prèviament condicionada l’aminoàcid 17 (0,395 g, 0,504 mmol, 45 % de rendiment) amb rentats successius amb diclorometà (DCM) i N,N-dime- com un sòlid blanc amb un RF = 0,55 (AcOEt/hexà 3:1). tilformamida (DMF). La síntesi dels pèptids s’ha efectuat mit- 1 H-RMN (360 MHz, CDCl3): d 11,51 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,78 jançant l’estratègia Fmoc/Boc. De la quantitat total sintetit- (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,36 (m, 11H), 5,23 zada, s’han utilitzat 1,87 g de la trans-γ-amino-l-prolina 18 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,97 (s, 1H), 4,53 i 1,38 g del γ-CBAA 3 per portar a terme la síntesi en fase sò- (m, 4H), 4,20 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 3,91 (s, 1H), 3,43 (m, 3H), 2,37 lida. El protocol general per a la síntesi es mostra en la tau- (m, 2H), 2,20 (m, 2H), 1,70 (m, 2H), 1,50 (s, 18H) ppm. la 1, on s’indiquen la funció del tractament, les proporcions 13 C-RMN (90 MHz, CDCl3): d 171,5, 163,6, 156,2, 155,8, emprades, el nombre de cicles i el temps en minuts de cada 153,3, 143,7, 141,3, 135,5, 128,6, 128,4, 128,2, 127,8, 127,1, cicle. 125,0, 120,1, 83,1, 79,3, 67,1, 66,7, 57,4, 52,5, 50,5, 47,2, 40,5, 34,8, 33,8, 28,6, 28,3, 28,1, 21,7 ppm. IR (ATR): 2 968, Cada cinc aminoàcids acoblats, es va realitzar una miniruptu- 1 719, 1 637, 1 326, 1 252, 1 132, 740 cm-1. ra del pèptid de la resina per seguir el progrés de la síntesi. Per fer-ho, es va prendre una petita quantitat de resina i es va Síntesi de l’àcid (2S,4R)-4-((9H-fluoren-9-il)metoxicarbo- tractar amb TFA, TIS i H2O (9,5:2,5:2,5, v/v) per tal de separar nilamino)-1-(5-(2,3-bis(tert-butoxicarbonil)guanidino) el pèptid de la resina i desprotegir tots els grups protectors de pentanoil)pirrolidin-2-carboxílic 18 la cadena lateral. Una vegada tractat, el pèptid es va carac- teritzar amb HPLC-MS. S’afegeix Pd/C al 10 % en pes (0,20 g) a una solució agitada de l’aminoàcid 17 (0,50 g, 0,64 mmol) en metanol (60 mL), Acoblament amb la 5(6)-carboxifluoresceïna (CF) purgada prèviament amb un corrent de nitrogen. Es purga la mescla de reacció resultant amb nitrogen. Es bombollegen dos Una vegada obtingut el tetradecàmer desitjat, la resina es va globus plens d’hidrogen a l’interior de la solució. Tot seguit, dividir en dues parts. La primera part (240 mg) va quedar pro- s’afegeix un globus ple d’hidrogen per mantenir la pressió tegida en forma de Fmoc i amb els 120 mg restants es va con- d’hidrogen constant. La reacció s’agita a temperatura ambient tinuar amb la incorporació de la CF en el grup amino de l’ex- durant 2 h. El cru de reacció es filtra amb Celite® i s’evapora trem N-terminal, tal com s’indica a la taula 2. el dissolvent a pressió reduïda. S’obté la trans-γ-amino-l- prolina 18 (0,41 g, 0,59 mmol, rendiment quantitatiu) en for- A continuació, es purifica el pèptid i es caracteritza completa- ma de cristalls groguencs sense cap etapa de purificació. ment, i es comprova que les dades coincideixen amb les des- 1 H-RMN (360 MHz, CDCl3): d 11,50 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,76 crites prèviament per al mateix compost [9]. (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,57 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,38 (m, 4H), 4,41 (m, 4H), 3,90 (m, 1H), 3,37 (m, 3H), 2,28 (m, 4H), 1,62 (m, 4H), 1,49 (s, 18H) ppm. IR (ATR): 3 319, 2 973, 1 719, 1 615, Conclusions 1 366, 1 327, 1 227, 1 132, 740 cm-1. En aquest article s’ha estudiat i desenvolupat la metodologia per a la síntesi en fase sòlida dels pèptids híbrids γ-­CBAA/ Síntesi en fase sòlida dels pèptids (SFS) γ-amino-l-prolina 1 i 2. Per portar a terme la síntesi d’aquests pèptids va ser prèviament necessària la preparació Tots els pèptids han estat sintetitzats de forma manual, utilit- del g-aminoàcid ciclobutànic 8, així com de la trans-γ-amino- zant xeringues de polipropilè que contenen un filtre de polie- l-prolina modificada 18, que es va portar a terme a partir de tilè porós. Les reaccions s’han dut a terme a temperatura am- l’acoblament de la cadena lateral 4 amb la γ-amino-l-prolina bient i amb agitació manual amb una vareta de tefló. comercialment assequible corresponent. L’eliminació dels excessos de reactius, dissolvents i possibles subproductes s’ha realitzat per mitjà de filtració al buit. La síntesi de la cadena lateral 4 es va realitzar per mitjà d’una 95 guanidilació de l’àcid 5-aminopentanoic 13. D’altra banda, la Taula 1. Protocol general per a la síntesi en fase sòlida dels pèptids g-CBAA/g-amino-l-prolina mitjançant l’estratègia Fmoc/Boc. Elaboració pròpia. Etapa Reactius/Dissolvents Funció Cicles t/cicle (min) 1 DMF Rentat 5   1 2 DCM Rentat 5   1 3 DMF Rentat 5   1 trans-g-amino-l-prolina 18/DIC/ 4 Acoblament 1 180 Oxyma Pure® en DMF (2:3:3) 5 DMF Rentat 5   1 6 DCM Rentat 5   1 7 Test de ninhidrina (–)* Test d’acoblament 1   3 8 DMF Rentat 5   1 9 Piperidina/DMF (2:8, v/v) Desprotecció 5 10 10 DMF Rentat 5   1 11 DCM Rentat 5   1 12 Test de ninhidrina (+) Test d’acoblament 1   3 13 DMF Rentat 5   1 g-CBAA 3 / Oxyma Pure®/ PyBOP/DIPEA 14 Acoblament 1 120 (2,5:2,5:2,5:5) en DMF/CH2Cl2 (1:1) 15 DMF Rentat 5   1 16 DCM Rentat 5   1 17 Test de ninhidrina (–) Test d’acoblament 1   3 18 DMF Rentat 5   1 19 Piperidina/DMF (2:8, v/v) Desprotecció 5 10 20 DMF Rentat 5   1 21 DCM Rentat 5   1 22 Test de ninhidrina (+) Test d’acoblament 1   3 * En el cas d’obtenir un test de ninhidrina positiu, s’acila la resina amb una solució de Ac2O/DIPEA (5:10) en DMF. Taula 2. Protocol general per a la incorporació de la CF. Elaboració pròpia. Etapa Reactius/Dissolvents Funció Cicles t/cicle (min) 1 DMF Rentat 5   1 2 DCM Rentat 5   1 3 DMF Rentat 5   1 4 CF/ Oxyma Pure®/ PyBOP/DIPEA (3:3:3:6) en DMF Acoblament 1 120 5 DMF Rentat 5   1 6 DCM Rentat 5   1 7 Test de ninhidrina (–) Test d’acoblament 1   3 8 Piperidina/DMF (4:6, v/v) Trencament de l’èster fenòlic 5 10 9 TFA/TIS/H2O (95:2,5:2,5) Desprotecció / Separació de la resina 1 120 96 10 DCM Rentat 5   1 trans-γ-amino-l-prolina modificada 18 es va preparar a par- tural study of highly constrained hybrid cyclobutane-proline tir d’una ruta sintètica de quatre etapes des de l’aminoàcid γ,γ-peptides». Amino Acids [en línia], 41 (2011), p. 673-686. comercialment disponible 5. Malgrat que alguna de les etapes . d’aquesta síntesi va donar un rendiment mitjà millorable que [7] Gorrea, E.; Carbajo, D.; Gutiérrez-Abad, R.; Illa, O.; Brancha- podria portar a futurs estudis per augmentar-lo, es va aconse- dell, V.; Royo, M.; Ortuño, R. M. «Searching for new cell-pene- guir sintetitzar una quantitat de 18 suficient per realitzar la trating agents: Hybrid cyclobutane-proline γ,γ-peptides». Org. posterior síntesi dels pèptids. La trans-γ-amino-l-prolina mo- Biomol. Chem. [en línia], 10 (20) (2012), p. 4050-4057. dificada 18, així com els seus intermedis de reacció van ser . caracteritzats per les tècniques de 1H-RMN, 13C-RMN i IR. [8] Illa, O.; Olivares, J. A.; Nolis, P.; Ortuño, R. M. «The relevance of the relative configuration in the folding of hybrid peptides Respecte a la síntesi en fase sòlida dels tetradecàmers 1 i 2, containing β-cyclobutane amino acids and γ-amino-l-proline després de realitzar diferents estudis dels agents d’acobla- residues». Tetrahedron [en línia], 73 (44) (2017), p. 6286- ment més adequats i d’augmentar la relació d’aminoàcid per 6295. . grup amino lliure de la resina, va ser possible obtenir els pèp- [9] Illa, O.; Olivares, J. A.; Gaztelumendi, N.; Martínez-Castro, L.; tids desitjats amb èxit, així com aïllar-los per fer-ne un ús Ospina, J.; Abengozar, M. Á.; Sciortino, G.; Maréchal, J. D.; Nogués, posterior en estudis biològics. C.; Royo, M.; Rivas, L.; Ortuño, R. M. «Chiral cyclobutane-con- taining cell-penetrating peptides as selective vectors for anti-­ Leishmania drug delivery systems». Int. J. Mol. Sci. [en línia], Referències 21 (20) (2020), article 7502. . [1] Kang, Z.; Ding, G.; Meng, Z.; Meng, Q. «The rational design of [10] Illa, O.; Ospina, J.; Sánchez-Aparicio, J.-E.; Pulido, X.; Abengo- cell-penetrating peptides for application in delivery systems». zar, M. Á.; Gaztelumendi, N.; Carbajo, D.; Nogués, C.; Rivas, L.; Ma- Peptides [en línia], 121 (2019), article 170149. . proline-containing peptidomimetics: The conformational [2] Harayama, T.; Riezman, H. «Understanding the diversity of constraint influences their cell-penetration ability». Int. J. membrane lipid composition». Nat. Rev. Mol. Cell Biol. [en lí- Mol. Sci. [en línia], 22 (10) (2021), article 5092. . 2017.138>. [11] Fominaya, J.; Bravo, J.; Rebollo, A. «Strategies to stabilize [3] Wang, F.; Wang, Y.; Zhang, X.; Zhang, W.; Guo, S.; Jin, F. «Re- cell penetrating peptides for in vivo applications». Ther. Del. cent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for [en línia], 6 (10) (2015), p. 1171-1194. . (2014), p. 126-136. . Asoodeh, A.; Rafati, S. «Comparative study of different forms [4] Xu, J.; Khan, A. R.; Fu, M.; Wang, R.; Ji, J.; Zhai, G. «Cell-­ of Jellein antimicrobial peptide on Leishmania parasite». Exp. penetrating peptide: A means of breaking through the physio- Parasitol. [en línia], 209 (2020), article 107823. . Release [en línia], 309 (2019), p. 106-124. . tive estimation of amino groups in insoluble specimens». Na- [5] Derakhshankhah, H.; Jafari, S. «Cell penetrating peptides: A ture [en línia], 197 (1963), p. 1305-1306. . Biomed. Pharmacother. [en línia], 108 (2018), p. 1090-1096. [14] Fischer, R.; Mader, O.; Jung, G.; Brock, R. «Extending the . applicability of carboxyfluorescein in solid-phase synthesis». [6] Gutiérrez-Abad, R.; Carbajo, D.; Nolis, P.; Acosta-Silva, C.; Co- Bioconjugate Chem. [en línia], 14 (3) (2003), p. 653-660. bos, J. A.; Illa, O.; Royo, M.; Ortuño, R. M. «Synthesis and struc- . 97 V. Maestre O. Illa M. Royo R. M. Ortuño Víctor Maestre es va graduar en química per la Universitat Autònoma de Barcelona l’any 2020. Va guanyar el Premi de la Societat Catalana de Química pel treball de final de grau Preparació de blocs quirals per a nous agents de penetració cel·lular, realitzat pel grup de recerca Síntesi, Estructura i Reactivitat Química (SERQ). Va ser guardonat amb una beca del Programa Màster+ UB per cursar el Màster en Química Orgànica a la Universitat de Barcelona (UB). Actualment treballa com a ajudant investigador a la Fundació Bosch i Gimpera i és professor associat del Departament de Química Inorgànica i Orgànica a la Facultat de Química de la UB. Ona Illa es va llicenciar en química per la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), on va obtenir el doctorat en química l’any 2005. Actualment és professora agregada de la UAB i el seu àmbit de recerca és el disseny i la síntesi de noves molècu- les funcionals per a aplicacions biològiques i en l’àrea dels materials. Miriam Royo és llicenciada en química per la Universitat de Barcelona (UB), on va obtenir el doctorat en química l’any 1994. Va realitzar una estada postdoctoral (1994-1996) al Beth Israel Deaconess Medical Center - Harvard Medical School de Boston, als Estats Units. El 1997 va tornar a la UB com a investigadora postdoctoral (1997-2001). El 2002 es va incorporar al Parc Científic de Barcelona, on va ser cap de la Unitat de Química Combinatòria fins al 2018. Actualment és investigadora científica a l’Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC), on lidera el grup de Sistemes Multivalents per Nano- medicina (MS4N) i el seu àmbit de recerca és la nanomedicina i la química biològica. Rosa M. Ortuño és catedràtica de la Universitat Autònoma de Barcelona des del 1993, emèrita des del 2021, i va ser direc- tora del Departament de Química d’aquesta universitat del 2013 al 2019. Ha liderat projectes sobre la síntesi, l’estudi supra- molecular i les aplicacions de nous surfactants, organogels i derivats peptídics. També ha col·laborat amb empreses del sec- tor farmacèutic. 98