Molts productes d’interès en l’àmbit dels processos biotecnològics es produeixen per fermentació bacteriana i especialment, pel que fa a proteïnes recombinants, a partir del cultiu de bacteris com Escherichia coli.
En aquest treball s’ha realitzat una caracterització fisiològica i metabòlica d’ Escherichia coli en cultiu en bioreactor per tal d’obtenir les claus que permetin una millora de l’eficiència del procés des de l’enfoc de l’Enginyeria Metabòlica. S’ha identificat un factor que impedeix millorar l’eficiència del procés: l’excreció de subproductes. L’acetat és el principal subproducte metabòlic en cultius aeròbics d’ Escherichia coli en medis minerals glucosats i, quan s’acumula al brou de fermentació, esdevé tòxic per a les cèl·lules, inhibint el creixement cel·lular i reduint l’expressió de gens recombinants.
L’anàlisi de la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars estimats per mitjà d’un model matemàtic del metabolisme basat en el plantejament de les equacions de balanç de matèria i l’estequiometria cel·lular, ha revelat que existeix un desajust entre la capacitat de captació i degradació de la glucosa fins a piruvat, producte final de la glucòlisi, i la d’incorporació d’Acetil-CoA al cicle dels àcids tricarboxílics (CAT). Aquest desajust impedeix a la cèl·lula aprofitar tota la glucosa captada per a funcions de biosíntesi i l’excreció d’acetat representa una vàlvula de seguretat pels excedents que la cèl·lula no pot aprofitar en la generació de nova biomassa i CO2.
En aquest estudi ha sigut possible identificar els enzims clau involucrats en les reaccions suposadament causants del desajust metabòlic a Escherichia coli, s’han aïllat els gens i regulat la seva expressió mitjançant plasmidis d’expressió adequats. Les reaccions escollides com a potencials llocs d’actuació són la reacció d’incorporació de glucosa a la cèl·lula a través del sistema de transport de la Fosfotransferasa depenent de fosfoenolpiruvat (PTS) i la reacció anapleròtica de reompliment del CAT catalitzada per l’enzim Fosfoenolpiruvat-carboxilasa (PEPC). En ambdós casos es pretén balancejar el creixement en cultiu discontinu, reduint la formació de subproductes.
La redistribució dels fluxos metabòlics per reducció del nombre de components EIICBGlc del sistema PTS mitjançant estratègies de silenciament de gens per RNA-Antisentit pel gen ptsG, així com la sobreexpressió del gen ppc que codifica per la PEPC ha permès reduir la formació d’acetat a Escherichia coli. La modificació dels nivells del component EIICBGlc del PTS ha permès redistribuir els fluxos sense afectar la velocitat específica de creixement. No obstant, la modificació dels fluxos per augment de la velocitat de reacció de la PEPC, ha afectat la velocitat específica de creixement i la velocitat específica de transport de glucosa.
En resum es pot concloure que algunes de les modificacions genètiques realitzades han resultat satisfactòries en termes de l’objectiu desitjat –reduir la secreció d’acetat- i que els efectes de la modificació sobre la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars es pot explicar a partir dels valors estimats pel model matemàtic.
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Many products of biotechnological interest are produced by bacterial fermentation, among then recombinant products, by the bacteria Escherichia coli.
In this work a physiological and metabolic study of Escherichia coli growing in a bioreactor it has been performed in order to obtain the parameters which permit an increase of the efficiency of the process from the point of view of Metabolic Engineering. It had been possible identify a limiting factor of the efficiency of the process: by-product generation. Acetate is the main by-product of the aerobic metabolism of Escherichia coli K12 in glucose minimal medium, and when it reaches a critical concentration becomes toxic for the cells, inhibiting the cell growth and reducing the expression of recombinant genes.
The analysis of distribution of intracel·lular metabolic fluxes by means of a metabolic model based on the mass balance equations and the stoichiometry of the cell, has shown an intracel·lular uncoupling between glycolisis and tricarboxylic acid cycle (TCA), at the level of Acetil-CoA incorporation to the cycle. Such uncoupling effect restricts the total conversion of glucose into cellular structures, and the excretion of acetate is used by the cell to export the exceeding carbons that are not converted to CO2 and biomass.
In this study it has been possible identify key enzymes that can have an important role in the metabolic uncoupling observed in E.coli cultured in vitro. Those reactions were the glucose uptake system (Phosphoenolpyruvate-Dependent Glucose Phosfotransferase system:PTS) and the anaplerotic reaction of Phosphoenolpyruvate Carboxilase (PEPC).
Redistribution of the intracellular metabolic fluxes by reduction of the number of components of EIICBGlc of PTS by RNA-Antisense strategy of the gene ptsG, and over expression of ppc gene of PEPC had allow to reduce the acetate formation in Escherichia coli. The modification of the PTS component had allowed redistributing the intracellular fluxes without affecting the specific cell growth rate. However, the modification of the flux across the PEPC reaction had modified the specific cell growth rate and the specific glucose uptake rate. In summary, some of the metabolic engineering approaches investigated resulted successful in terms of the desired goal, and the effects of the genetic modifications on redistribution of the cell metabolism could be explained from the model based intracellular fluxes estimated.
