Nuestro grupo ha estudiado la estructura de la cromatina de núcleos de eritrocitos de pollo (Bartolomé et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al., 1998). La consecuencia de estos estudios ha sido la elaboración de un modelo para el plegamiento de la fibra de cromatina con una elevada concentración local del DNA (Daban y Bermúdez, 1998; Daban, 2000). Sin embargo, el nivel máximo de condensación en la cromatina, se encuentra en el interior de los cromosomas metafásicos. Aunque la bibliografía ha planteado diferentes modelos para el plegamiento de la cromatina en el interior de éstos, existe un conocimiento muy escaso acerca de la estructura molecular de la cromatina en los cromosomas condensados.
Se ha realizado un estudio exhaustivo de microscopía electrónica de transmisión sobre la estructura de los cromosomas metafásicos de células HeLa. Se han estudiado un total de 4410 micrografías de cromosomas metafásicos, que en su mayor parte han sido tratados con diversos medios parcialmente desnaturalizantes, para poder analizar su estructura interna.
Morfológicamente, los cromosomas estudiados en este trabajo pueden agruparse en tres tipos diferentes: compactos, granulados y fibrilados. La morfología más abundante es la compacta y se observa en presencia de cationes monovalentes y divalentes a concentración similar a la presente en la cromatina metafásica (Mg2+ 1.7-40 mM). Estos cromosomas tienen las cromátidas muy densas y en sus bordes se aprecian una serie de estructuras planas superpuestas. En condiciones de menor concentración de cationes (Mg2+£ 1.7 mM), la morfología dominante es la granular. Estos cromosomas están compuestos principalmente por gran cantidad de cuerpos circulares de 30-40 nm de diámetro. Únicamente en condiciones de fuerza iónica extremadamente baja podemos encontrar la morfología fibrilar, la cual se caracteriza por la abundancia de fibras de 30-40 nm.
Los resultados obtenidos con cromosomas parcialmente desnaturalizados nos permiten concluir que existen tres elementos estructurales en el interior de los cromosomas metafásicos: la fibra, el gránulo y la placa.
Las fibras gruesas con diámetros que oscilan entre los 100 y los 500 nm son el resultado de la deformación plástica de las cromátidas durante los diferentes procesos de preparación de las muestras. En función de las condiciones iónicas del medio las fibras gruesas muestran gránulos o placas en su interior. Las fibras delgadas están formadas por una sucesión de cuerpos de 30-40 nm de diámetro unidos irregularmente mediante interacciones cabeza-cola. Las fibras delgadas se observan dominantemente en condiciones de concentración salina extremadamente baja.
Los gránulos son unos cuerpos circulares compactos de unos 30-40 nm de diámetro. Estos cuerpos compactos descritos previamente por nuestro grupo y se interpretaron como una forma de plegamiento solenoidal de la fibra de 30 nm (Daban y Bermúdez, 1998). Se encuentran presentes en todas las condiciones estudiadas en este trabajo, siendo especialmente abundantes en presencia de iones divalentes a concentración baja y en muestras tratadas con nucleasa micrococal.
La placa es un elemento estructural característico de los cromosomas cuando éstos se encuentran en su forma más compacta, en presencia de concentraciones elevadas de cationes divalentes. Esta estructura no había sido descrita previamente por otros laboratorios. Es una estructura cromatínica de gran regularidad y con una superficie muy lisa. Hemos estimado la altura de estas placas a través de muestras sombreadas unidireccionalemente con platino. El promedio de los valores obtenidos es de 6.7 ± 1.4 nm.
En conjunto los resultados obtenidos en esta tesis permiten sugerir que el componente principal de la cromatina en los cromosomas metafásicos es el gránulo de 30-40 nm. Dependiendo de las condiciones iónicas, este elemento estructural fundamental se agrega a través de uniones cabeza-cola para formar fibras (fuerza iónica muy baja), o bien se agrega mediante interacciones laterales para formar placas (condiciones salinas próximas a las de la cromatina metafásica).
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Our group has studied the chromatin structure in the chicken erythrocyte nuclei (Bartolome et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al., 1998). The consequences of this studies has been the elaboration of a folding model of the chromatin fiber with a high local concentration of DNA. However, the maximum level of chromatin condensation, is found in the metaphase chromosomes. Although the bibliography has proposed different models to explain the chromatin folding inside the chromosomes, there is a low knowledge about the molecular structure of chromatin in the condensed chromosomes.
In this thesis, we have carried out an exhaustive electron microscopy study about the HeLa cells metaphase chromosomes. We have studied a large number of chromosome electron micrographs (4410). Chromosomes were partially denaturated under a wide variety of conditions in order to observe some chromatin structural element inside them.
Our studies indicate that chromosomes can adopt three global structural forms in function of the ionic conditions: compact, granular and fibrillar.
The compact form is the most frequent and we can observe it in the presence of monovalent and divalent cations in similar concentrations than the ones found in metaphase chromatin (Mg2+ 1.7-40 mM). These chromosomes have highly condensed chromatids and we can appreciate overlapped chromatin plates around the chromosomes edges. When the chromosomes are incubated with solutions containing lower cations concentration (Mg 2+£ 1.7 mM) they become granular. The granular structures seen inside these chromosomes show a diameter of about 35 nm. Fibrillar chromosomes are observed only at very low ionic strength. The fibers seen emanating from the chromatids have a diameter of 30-40 nm.
Our results obtained from partially denaturated chromosomes show that there are three structural elements inside the metaphase chromosomes: the fiber, the 30-40 nm chromatin granule and the plate.
The largest fibers with a diameter of 100-400 nm, presumably are produced by mechanical deformation of chromosomes during the preparation processes. Depending of the ionic conditions these fibrillar structures are composed by plates or granules. The thinnest fibers are formed by face to face association of the 30-40 nm chromatin granules. These kind of fibers are usually found only at very low ionic strength.
The chromatin granules are compact bodies with 35 nm of diameter. These compact bodies were previously described in our laboratory and were modeled as compact solenoids of nucleosomes forming (Daban and Bermúdez, 1998). They are usually seen at low divalent cation concentrations and in chromosome samples treated with micrococal nuclease.
The plate is the most frequent structural element when the chromosomes are in their compact form (high ionic strength, similar to physiological conditions). This element has not been described by any group. It is a chromatin element with a regular structure and very smooth surface. We have estimated the height of the steps between layers in unidirectional shadowing experiments. The value obtained is 6.7 ± 1.4 nm.
Our results suggest that the fundamental component inside the metaphase is the 30-40 nm chromatin granules. Depending of the ionic conditions, this basic structural element forms fibers through face to face interactions (very low ionic strength) or form plates through side to side interactions (high ionic strength similar to metaphase chromatin).
