El objetivo final de nuestro trabajo es la obtención de proteínas recombinantes de interés farmacológico en la leche de animales transgénicos de producción. En nuestro grupo, previamente a este trabajo, se han llevado a cabo distintos proyectos con el fin de estudiar las regiones reguladoras del gen de la b-lactoglobulina (bLG) caprina y obtener así un cassette de expresión que pueda dirigir la expresión del transgén de forma específica y eficaz a la glándula mamaria de los animales transgénicos. Todas las construcciones han sido testadas previamente en el ratón al ser un modelo animal más barato ya que presenta un menor coste de mantenimiento y su ciclo reproductivo e intervalo generacional es más corto con respecto a los animales de producción.
En el presente trabajo se ha utilizado un cassette de expresión que contiene 410 pb de región promotora proximal y 2,5 kb de región 3’ flanqueante del gen de la bLG caprina para dirigir la expresión de las dos subunidades (a y b) de la Hormona Estimulante del Folículo (FSH) humana a la glándula mamaria de ratones transgénicos. Se han obtenido 4 líneas transgénicas que son capaces de expresar los dos transgenes en su glándula mamaria.
Por otra parte, en la obtención de ratones transgénicos para el transgén de la bLG caprina, con el fin de testar las regiones reguladoras del gen, se observó un fenotipo conspicuo en los ratones homocigotos de la línea tg56; en el presente trabajo se ha caracterizado el lugar de integración de este transgén, el cual provocó una mutación por inserción en el gen de la Fosfolipasa C-b1 (PLC-b1) del ratón.
Asimismo, se ha desarrollado una nuevo protocolo basado en la PCR cuantitativa a tiempo real para determinar el número de copias integradas del transgén en las distintas líneas transgénicas. Este método puede ser utilizado en todas aquellas líneas transgénicas que contengan cassettes de expresión pertenecientes a genes de especies rumiantes.
Por último se han identificado y caracterizado un total de 15 polimorfismos en el gen de la bLG caprina, 9 de los cuales se encuentran localizados en la región promotora proximal, con el fin de encontrar mutaciones en las regiones reguladoras que puedan ser importantes en la expresión del gen.
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The final aim of this project is to produce pharmaceutical recombinant proteins in milk of farm animals. Previous works of our group have been performed to study the caprine b-lactoglobulin (bLG) regulatory sequences resulting in a expression cassette that is able to target the expression of the transgene to the mammary gland of transgenic mice in an integration-site dependent manner, independently of the number of copies in the array. All the constructions have been previously tested in a mouse model due to their short generation intervals and ease of genetic manipulation being cheaper than farm animals.
In the present work, a goat bLG expression cassette which contained 410 bp of proximal promoter region and 2.5 kb of 3’ flanking region has been used to target the expression of the two subunits (a and b) of human Follicle Stimulating Hormone (hFSH) to the mammary gland of transgenic mice. Four established transgenic lines that express both hFSH transgenes (a and b) to their mammary gland have been obtained.
On the other hand, homozygous mice from one (tg56) of the different transgenic lines, that have been previously obtained for the goat bLG gene to study the regulatory sequences, displayed a distinct phenotype. Here, we present the identification and characterization of the transgene-induced insertional mutation at the PLC-b1 locus (PLC-b1bLG) in line tg56 of bLG transgenic mice.
Furthermore, a rapid and accurate real-time quantitative PCR-based system to determine transgene copy number in transgenic animals has been developed. This method can be used directly for the analysis of transgenic mice for transgenes with different ruminant sequences without the requirement of control sample previously quantified by blotting techniques.
Finally, fifteen polymorphisms, nine in the promoter region, of the caprine bLG gene have been identified and characterized. The main aim of this study has been identified mutations in the proximal promoter region that could be important in the expression of the gene.
