dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
| Publicació: |
[Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2016 |
| Descripció: |
1 recurs electrònic (148 p.) |
| Resum: |
L'ús cada cop més extensiu de plataformes "òmiques" per a l'estudi de llevats ha generat grans quantitats d'informació relativa a la fisiologia cel·lular sota diferents condicions de cultiu, la qual pot ser utilitzada per al desenvolupament de noves estratègies d'enginyeria genètica. S'ha observat que els nivells d'expressió d'un fragment d'anticòs humà produït en el llevat metilotròfic Pichia pastoris augmenten significativament quan aquest és cultivat en nivells de baixa disponibilitat d'oxigen. Anàlisis transcriptòmics mostren que hi ha una regulació important dels gens involucrats en el metabolisme de lípids i la resposta al mal plegament de proteïnes (UPR), destacant la l'augment de transcrits provinents de gens involucrats en les rutes de biosíntesi de l'ergosterol i esfingolípids. A més, s'ha observat que la presència en el medi de cultiu de fluconazol, un agent antifúngic que inhibeix específicament l'activitat de la esterol C14α-demetilasa (Erg11p) en la ruta de biosíntesi de l'ergosterol, resulta en una disminució dels nivells d'ergosterol en les membranes cel·lulars, millorant els nivells de proteïna recombinant secretada al medi de cultiu. Finalment, el factor de transcripció Hac1, amb un paper important en la regulació de la UPR, també es troba involucrat en la regulació de la síntesi de lípids. En el present estudi, la soca de referència, P. pastoris que produeix el fragment d'anticòs 2F5 de manera recombinant, s'ha modificat genèticament per tal de canviar la seva composició lipídica. S'ha generat una bateria de soques que presenten alguns gens de la ruta de biosíntesi d'esfingolípids delecionats (DES1, SUR2), o bé sobreexpressats (DES1). Al mateix temps, s'ha alterat la ruta de síntesi de l'ergosterol de la soca de referència mitjançant la sobreexpressió del gen ERG11 o tractant les cèl·lules amb fluconazol. Finalment, també es va sobreexpressar HAC1. Les cèl·lules es van cultivar en cultius en continu sota condicions d'oxigen normals (normoxia), i baixos (hipòxia), i les soques van ser caracteritzades en quant a nivells de Fab produïts, la seva distribució intra/extracel·lular, morfologia a partir d'estudis de microscòpia electrònica (TEM), i el seu contingut lipídic, quantificant els nivells d'àcids grassos, fosfolípids, esterols, lípids neutres i esfingolípids. Amb tota aquesta informació es pretén comprendre com les cèl·lules s'adapten a canvis genètics i ambientals a través de canvis en el seu contingut lipídic. Els resultats obtinguts s'han combinat amb informació transcriptòmica prèviament publicada, demostrant que existeix una important remodelació del metabolisme lipídic quan les cèl·lules es troben en condicions d'hipòxia. |
| Resum: |
The increasing availability of omics databases provides an important knowledge base for the design of novel yeast engineering strategies, since they offer systems-level information on the physiology of the cells under diverse growth conditions and genetic backgrounds. In a previous study, a beneficial effect of low oxygen availability on the expression of a human Fab fragment in Pichia pastoris has been identified. Transcriptomic analyses pointed out important regulation of the Unfolded Protein Response (UPR) and lipid metabolism, with a significant transcriptional up-regulation of ergosterol and sphingolipid biosynthetic pathways. Furthermore, cells cultured in the presence of fluconazole, an antifungal agent that inhibits sterol C14α-demethylase (Erg11p) activity in the ergosterol biosynthetic pathway, showed a reduced amount of ergosterol in the plasma membrane, resulting in increased protein secretion levels. Moreover, it is known that the transcription factor Hac1, which plays a key role by regulating the UPR, regulates lipid biosynthesis In the present study, a reference strain of P. pastoris secreting the 2F5 Fab antibody fragment as a model recombinant protein was genetically modified in order to change its lipid composition. A set of strains harbouring either deleted (DES1, SUR2) or overexpressed (DES1) genes of the sphingolipid pathway were generated. In addition, a Fab producing strain overexpressing HAC1 or ERG11 were constructed and, as an alternative to the ergosterol pathway knockout, the reference strain was treated with fluconazole. The series of strains were cultivated in chemostat cultures under normoxic and hypoxic conditions. Strains were characterised in terms of Fab- productivity, intra/extracellular product distribution, cell morphology by transmission electron microscopy (TEM) and lipid content in terms of phospholipids, fatty acids, sterols, non-polar lipids and sphingolipids, in order to fully understand how cells adapt to genetic and environmental changes involving lipid changes. The obtained results were combined with previously published transcriptional data, allowing us to demonstrate an important remodelling of the lipid metabolism under limited oxygen availability. |
| Nota: |
Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental, 2016 |
| Nota: |
Bibliografia |
| Drets: |
L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons  |
| Llengua: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Versió publicada |
| Matèria: |
Lípids ;
Pichia Pastoris ;
Proteïnes recombinants ;
Enginyeria genètica |
| ISBN: |
9788449063169 |
visitant ::
identificació
