dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Ciència Animal i dels Aliments)
dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals)
| Publicació: |
Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2003 |
| Resum: |
La producci¨®n in vitro (PIV) de embriones caprinos mediante t¨¦cnicas de maduraci¨®n, fecundaci¨®n y cultivo embrionario in vitro (MIV-FIV-CIV) proporciona un elevado n¨²mero de embriones utilizables a nivel cient¨ªfico y/o comercial El objetivo del este estudio ha sido seleccionar ovocitos de cabra prepuber y sistemas de maduraci¨®n in vitro para mejorar la producci¨®n in vitro de embrines. Los ovocitos se maduraron en medio TCM199 + piruvato s¨®dico + L-glutamina + gentamicina + 10% suero bovino de macho castrado (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. Tras 27 h de MIV, los ovocitos se inseminaron con semen fresco (3. 5x106 espermatozoides/ml) en medio TALP suplementado con 1 mg/ml de hipotaurina. A las 24 h post-inseminaci¨®n, se cultivaron en medio SOFm y se mantuvieron 7 d¨ªas en cultivo. En el Estudio 1, se evalu¨® la utilidad del test de Azul de Cresol Brillante (BCB) para seleccionar los ovocitos de cabras prep¨²beres. Los ovocitos BCB+ (ovocitos con citoplasma coloreado de azul, crecimiento finalizado) presentaron un mayor di¨¢metro (136. 6 ¡À 6. 3 mm; P<0. 001) y mayores tasas de maduraci¨®n nuclear (81. 4%; P<0. 05), fecundaci¨®n normal (23. 5%; P<0. 0001) y desarrollo m¨¢s all¨¢ del estadio de 8 c¨¦lulas (41. 3%; P<0. 001) y de m¨®rulas m¨¢s blastocistos (12. 0%; P<0. 05) que los ovocitos no coloreados de azul. En el Estudio 2, se utiliz¨® el Factor de Crecimiento Epid¨¦rmico (EGF), para la maduraci¨®n in vitro. Para ello, se compar¨® un medio suplementado con hormonas (LH, FSH y 17b-estradiol) y suero (SS o FCS) con un medio suplementado con 10 ng de EGF en ausencia de suero y hormonas. El porcentaje de ovocitos fecundados de forma normal fue inferior (P<0. 05) cuando se emple¨® EGF (17. 3%) que SS (SS: 27. 2%; FCS: 29. 0%). Las tasas de embriones totales (71. 5%) y de embriones que superaron el estadio de 8 c¨¦lulas (26. 2%) fueron superiores (P<0. 05) al emplear SS y hormonas en el medio de maduraci¨®n. En el Estudio 3, se analiz¨® el efecto de la adici¨®n de compuestos tiol (100 ¦ÌM de cisteamina, 100 ¦ÌM de b-mercaptoetanol, 0. 57 mM de ciste¨ªna y 0. 57 mM de cistina) al medio de MIV. Los ovocitos madurados en presencia de cisteamina y b-mercaptoetanol mostraron mayor capacidad (P<0. 01) para formar el pron¨²cleo masculino tras la penetraci¨®n esperm¨¢tica (88. 0% y 97. 1%) y para ser fecundados (P<0. 01) de forma normal (72. 0% y 77. 1%) comparados con el grupo control (62. 2% y 37. 8%, respectivamente). Asimismo, la adici¨®n de cisteamina al medio de MIV mejor¨® (P<0. 05) el porcentaje de embriones que alcanzaron los estadios de m¨®rula y blastocisto (22. 2%) y la tasa de blastocistos expandidos (13. 0%) respecto al grupo control (6. 4% y 2. 6%, respectivamente). La concentraci¨®n de GSH intracelular (pmol/ovocito) fue superior en los ovocitos MIV que en los ovocitos inmaduros. En el Estudio 4 se evalu¨® el efecto de la adici¨®n de cisteamina al medio de maduraci¨®n de ovocitos de cabra prep¨²ber seleccionados mediante el test de Azul de Cresol Brillante (BCB) sobre la maduraci¨®n nuclear, fecundaci¨®n y desarrollo embrionario in vitro. En presencia de cisteamina, el porcentaje de ovocitos BCB+ y madirados con cisteamina mejoraron la maduraci¨®n nuclear, los fecundados normales, la formaci¨®n del pronucleo masculino y el porcentage de embriones a las 8 celulas, comparados con el control y BCB-. En presencia de cisteamina, la formaci¨®n de m¨®rulas y blastocistos fue superior (P<0. 001) en los ovocitos BCB+ (23. 8%). En conclusi¨®n, la selecci¨®n ovocitaria mediante el test de BCB y la MIV en presencia de cisteamina permiten una mayor capacidad de desarrollo tras MIV-FIV-CIV. Sin embargo, a pesar de obtener resultados aceptables en los par¨¢metros de maduraci¨®n nuclear y de fecundaci¨®n in vitro, el desarrollo embrionario contin¨²a siendo reducido. |
| Resum: |
In vitro production (IVP) of caprine embryos using techniques of in vitro maturation, fertilization and embryo culture (IVM-IVF-IVC) provide a high number of embryos. The aim of the present studies has been the establishment of a system of selection and in vitro maturation of oocytes adequate for competence to develop until blastocyst after in vitro fertilization and embryo culture. For this, oocytes were matured in TCM199 + sodium pyruvate + L-glutamine + gentamicine + 10% steer serum (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. After 27 h of IVM, the oocytes were inseminated with fresh sperm (3. 5x106 sperm/ml) in TALP medium supplemented with 1 mg/ml hypotaurine. A t 24 h post-insemination, the presuntive zygotes were cultued in SOFm medium and were maintained 7 days in culture. In Study 1, the utility of the Brilliant Cresyl Blue (BCB) test was evaluated . The BCB+ oocytes (oocytes with blue coloured cytoplasm, fully-grown oocytes) presented a bigger diameter(136. 6 ¡À 6. 3 mm; P<0. 001) and higher rates of nuclear maturation (81. 4%; P<0. 05), normal fertilization (23. 5%; P<0. 0001), development beyond the 8-cell stage (41. 3%; P<0. 001) and morulae plus blastocyts (12. 0%; P<0. 05) . In Study 2, the use of an chemically defined medium, based in Epidermal Growth Factor (EGF) for the in vitro maturation of prepubertal goat oocytes was investigated. A medium supplemented with hormones and serum (SS or FCS) was compared with a medium with 10 ng EGF. The percentage of normally fertilized oocytes was lower when EGF (17. 3%) was employed (SS: 27. 2%; FCS: 29. 0%). The rate of total embryos (71. 5%) and embryos that developed beyond the 8-cell stage (26. 2%) were higher (P<0. 05) when SS and hormones was used. In Study 3, the effect of the addition of thiol compounds (100 ¦ÌM cysteamine, 100 ¦ÌM b-mercaptoethanol, 0. 57 mM cysteine and 0. 57 mM cystine) to the IVM medium was analyzed. The oocytes matured in the presence of cysteamine and b-mercaptoethanol showed a better ability to form the MPN and to be normally fertilized (P<0. 01; 72. 0% y 77. 1%) compared to the control group. The addition of cysteamine to the IVM medium improved the percentage of embryos that reached the m¨®rula plus blastocyst stage (22. 2%) and the expanded blastocyst formation rate (13. 0%) related to the control group. The intracellular GSH concentration (pmol/oocyte), was higher in the oocytes tIVM than immature oocytes. In Study 4, the addition of cysteamine to the IVM medium of oocytes selected by the Brilliant Cresyl Blue (BCB) was studied. The control group oocytes, no exposed to the BCB test, were matured in the same medium, but without cysteamine. In the presence of cyteamine, the percentage of oocytes that matured nuclearly was of BCB+ oocytes (89. 5%). , while this rate was higher in the presence of cysteamine (77. 8%). 97. 0% of the penetrated oocytes exhibited ability to form MPN and a 69. 7% were able to develop the 2 pronuclei, being these percentages significantly higher. The exposed oocytes to the BCB with cysteamine showed a lower percentage of non-decondensed heads (3. 0%) than the control group (25. 6%). Embryos developed beyond the 8-cell stage was higher in the BCB+ (68. 3%). Likewise, in the presence of cysteamine, the morule plus blastocysts formation rate was higher (P<0. 001) in the BCB+ oocytes (23. 8%) related to the BCB- oocytes (5. 1%). In conclusion, oocytes selection using the BCB test and the IVM in the presence of cysteamine allow a better development ability after IVM-IVF-IVC. In the present studies, we have been able to confirm an improvement in the oocytes development in relation with the initial IVM system, acting on growing and final maturation phases. |
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Títol obtingut de la portada digitalitzada |
| Nota: |
Tesi doctoral -- Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Veterinària, Departament de Ciència Animal i dels Aliments, 2001 |
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Bibliografia |
| Drets: |
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| Llengua: |
Castellà |
| Document: |
Tesi doctoral |
| Matèria: |
Oòcits ;
Maduració ;
Embriologia ;
Fecundació in vitro humana |
| ISBN: |
8468810460 |
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