Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/165736
Study of the transport mechanism of the melibiose permease from Escherichia coli / memòria presentada per Li-Ying Wang ; treballs presentats dirigits pels Drs. Esteve Padrós i Morell i Josep Bartomeu Cladera Cerdà
Ying Wang, Li
Padrós, Esteve, dir.
Cladera i Cerdà, Josep, dir.
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: [Bellaterra] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2015
Descripció: 1 recurs electrònic (149 p.) : il., gràf.
Resum: El transportador de melibiosa d'Escherichia coli (MelB) pot utilitzar l'energia electroquímica tant de H+, Na+ o Li+ per transportar la melibiosa a l'interior de les cèl·lules en contra del seu gradient de concentració. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids disposats en 12 hèlices transmembrana, amb els extrems N- i C-terminal situats al costat citoplàsmic. Mitjançant l'ús de mètodes espectroscòpics i bioquímics, hem analitzat el paper d'alguns aminoàcids en el bucle 7-8/final d'hèlix VII, que conté diversos aminoàcids aromàtics altament conservats, així com dos residus carregats negativament. Aplicant tècniques de mutagènesi, es van obtenir mutants individuals en què cada aminoàcid s'ha canviat a cisteïna excepte Ser-259, que també es va canviar a alanina. L'espectroscòpia de fluorescència va mostrar que els mutants dels aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 i Tyr-260 no uneixen substrats, i els espectres de diferència d'infrarojos de Y256C i Y260C van confirmar l'absència d'unió al substrat. Simulacions de dinàmica molecular van mostrar que aquests residus aromàtics formen part d'un bloc d'interaccions hidrofòbiques que jugaria un paper destacat en el mecanisme de transport. D'altra banda, els espectres de fluorescència i de diferència d'infraroig van demostrar que el mutant Cys del residu Asp-266 i del restant aminoàcid aromàtic del bucle 7-8 Phe-268 són capaços d'unir sodi i melibiosa en una forma semblant a la MelB nativa (Cless). Altres mutants de cisteïna (S259C, S259A, V261C, G263C, D264C, A265C i L267C) del bucle 7-8/final d'hèlix VII mostren una capacitat d'unió similar a Cless. Aquests resultats suggereixen que els aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-Tyr-258 i 260 tenen un paper estructural important en el mecanisme de transport de la MelB.
Resum: The melibiose transporter from Escherichia coli (MelB) can use the electrochemical energy of either H+, Na+ or Li+ to transport the melibiose to the cell interior against its concentration gradient. MelB is a protein of 473 amino acids arranged in 12 transmembrane helices, with the N- and C-terminus located in the cytoplasmic side. By using spectroscopic and biochemical methods, we have analyzed the role of some amino acids in the loop 7-8/end of helix VII, which contains several highly conserved aromatic amino acids as well as two negatively charged residues. Applying mutagenesis techniques, we obtained single mutants in which each amino acid has been changed to cysteine except Ser-259 also changed to alanine. Fluorescence spectroscopy showed that mutants of the conserved amino acids Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 and Tyr-260 did not exhibit substrate binding, and the infrared difference spectra of Y256C and Y260C also showed no substrate binding. Molecular dynamics simulation experiments pointed out that these aromatic residues make part of a hydrophobic lock that would play a significant role in the transport mechanism. On the other hand, infrared difference and fluorescence spectra demonstrated that the Cys mutant of Asp-266 and the remaining aromatic amino acid of loop 7-8 Phe-268 are able to bind sodium and melibiose in a similar way as the wild type MelB (Cless). Other cysteine mutants (S259C, S259A, V261C, G263C, D264C, A265C and L267C) of the loop 7-8/end of helix VII show similar binding capacity as Cless. These results suggest that the conserved amino acids Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 and Tyr-260 have an important structural role in the MelB transport mechanism.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2015
Drets: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: Proteïnes de membranes ; Anàlisi espectral ; Melibiosa ; Proteïnes ; Transport fisiològic
ISBN: 9788449062278

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/377470


6.5 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2016-10-17, darrera modificació el 2016-10-18



   Favorit i Compartir