Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/36897
Proteïnes petites i riques en ponts disulfur com a models de producció recombinant i plegament / Sílvia Bronsoms i Fabrellas
Bronsoms i Fabrellas, Sílvia
Avilés, Francesc X., (Francesc Xavier) dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Institut de Biotecnologia i Biomedicina)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2003
Resum: El PCI, la hirudina i el LCI formen part de la família de proteïnes petites i riques en ponts disulfur, que conté un gran nombre de biopèptids amb potencials aplicacions biotecnològiques, com són els factors de creixement, les toxines, els inhibidors de proteases o desintegrines. A causa de la presència dels ponts disulfur l'expressió recombinant d'aquestes proteïnes és complexa. En el primer treball de la tesi s'estudien tres sistemes de producció recombinant: un sistema eucariota (Pichia pastoris) i dos sistemes procariotes (Escherichia coli). S'optimitzen diversos paràmetres per tal de millorar el seu nivell de producció i es busquen sistemes que permetin simplificar el seu procés de purificació. S'aconsegueix desenvolupar un sistema en E. coli amb una producció final de proteïna que és 10 cops superior al sistema de partida. En el segon treball s'analitza el paper de les regions precursores del PCI en el plegament de la forma madura. S'analitza el procés de replegament oxidatiu in vitro de les diverses pro-formes del PCI per tal de caracteritzar la seva influència sobre la velocitat o la eficiència del plegament de la forma madura. També s'estudia la influència de la pro-regió N-terminal sobre el procés de plegament in vivo en E. coli del PCI madur i d'una sèrie de mutants que presenten un mal plegament o un baix nivell d'expressió recombinant. Finalment es duu a terme una caracterització estructural de la forma corresponent al PCI amb la pro-regió N-terminal a través d'estudis de bescanvi protó/deuteri, exoproteòlisi limitada, espectroscopia de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear. En l'últim treball s'analitza el procés de plegament proteic de la hirudina i del LCI a través de l'estudi de les reaccions de bescanvi protó/deuteri seguides per espectrometria de masses MALDI-TOF. Es caracteritza l'adquisició d'estabilitat conformacional al llarg del procés de plegament de les dues proteïnes. S'aïllen una sèrie d'intermediaris de plegament i es determina la seva estabilitat; la qual cosa ens permet estudiar les diferències existents entre les vies de plegament de les dues proteïnes. Finalment s'estima la contribució de les interaccions covalents i no-covalents en l'estabilitat final de la proteïna nativa.
Resum: PCI, hirudin and LCI belong to the familly of small disulfide-rich proteins, which also contains other biologically important biopeptides like growth factors, desintegrins, toxins or protease inhibitors. These proteins cannot be usually produced at high levels by recombinant DNA approaches due to the presence of the disulfide bridges. To deal with this, we selected three different systems for heterologous expression: one based in external secretion by the yeast Pichia pastoris and two others based in the periplasmic secretion in Escherichia coli, using powerful promoters in all cases. Several parameters were optimized to improve PCI production and to simplify the purification protocol. Finally, a new method was developed, which lead to a final PCI production 10-fold higher than the previously described system. In the second work of the thesis, the role of the PCI pro-regions on the mature peptide folding was analyzed. The in vitro oxidative refolding of mature PCI was compared with that of the pro-forms to characterize their influence on mature PCI folding rates and folding efficiency, using RP-HPLC to analyze the acid-trapped disulfide intermediates collected during the refolding process. The influence of the N-terminal pro-region on the expression or folding of several PCI variants reported to give a low expression yield or a low folding efficiency in vivo in E. coli was also studied. In addition, the presence of ordered structural elements in the N-terminal extension of PCI was investigated by deuteron to proton exchange, limited exoproteolysis, circular dicroism spectroscopy and nuclear magnetic ressonance. In the last work, the folding process of hirudin and LCI was analyzed by deuteron to proton exchange monitored by MALDI-TOF mass spectrometry. The comparison of the number of slow exchanging protons of different samples along the folding pathway provided an easy and fast way to follow the protein folding process. Additionally, the deuteron to proton exchange experiments on purified folding intermediates allowed us to characterize the differences between the two folding pathways and to measure the contribution of the disulfide bonds versus the non-covalent forces to the stability of the native protein.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2002
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
Drets: ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Proteïnes ; Plegaments ; Proteïnes recombinants ; Espectrometria de masses
ISBN: 8468802220

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3481


10 p, 170.0 KB

19 p, 322.2 KB

9 p, 319.0 KB

14 p, 162.4 KB

21 p, 434.7 KB

40 p, 215.3 KB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



   Favorit i Compartir