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Efecto de la criopreservación sobre la estructura del huso meiótico de ovocitos humanos madurados in vitro / Memoria presentada por Irene Boiso Fedorovsky (...)
Boiso Fedorovsky, Irene
Santaló, Josep, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, de Fisiologia i d'Immunologia)
Veiga, Anna, dir. (Institut Universitari Dexeus)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2003
Resum: La presente tesis analiza el efecto de un protocolo de frecuente aplicación clínica (de congelación lenta y descongelación rápida, utilizando 1,2 propanediol y sacarosa como crioprotectores) sobre la supervivencia, la capacidad de maduración in vitro y la estructura del huso meiótico de ovocitos humanos, congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II. Para llevarlo a cabo se plantearon los siguientes objetivos parciales: a) Desarrollar y validar un modelo de estudio a partir de ovocitos madurados in vitro. Este estudio ha permitido demostrar mediante análisis citogénetico y de FISH que la maduración in vitro de ovocitos no induce per se un incremento de la tasa de aneuploidías, por tanto que los ovocitos madurados in vitro constituyen un modelo válido de estudio. b) Determinar la capacidad de maduración in vitro de los ovocitos de cada uno de los grupos experimentales. El cultivo in vitro de ovocitos se realizó en líquido folicular proveniente de folículos estimulados. En este estudio no se observaron diferencias en la tasa de maduración ni diferencias en el tiempo de cultivo requerido para alcanzar el estadío de metafase II en los ovocitos asignados a los distintos grupos experimentales. c) Determinar la tasa de supervivencia de ovocitos humanos congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II al proceso de congelación-descongelación. Este estudio ha demostrado que los ovocitos congelados en estadío de vesícula germinal son desde el punto de vista morfológico más resistentes al daño crioinducido que los ovocitos criopreservados en metafase II. En ambos casos se observan tasas de supervivencia elevadas, comparables a las publicadas en la bibliografía anteriormente. También se ha demostrado que el proceso de criopreservación en estadío de vesícula germinal no afecta la capacidad de los ovocitos para reiniciar la progresión meiótica hasta metafase II, ya que no se han detectado diferencias significativas en el tiempo requerido para la extrusión del primer corpúsculo polar antes y después de la congelación, ni en las respectivas tasas de maduración. d) Determinar la estructura del huso meiótico en ovocitos humanos congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II comparándola con la de ovocitos no criopreservados, para lo que se desarrolló una técnica de tinción inmunocitoquímica del huso meiótico. Este estudio ha permitido determinar que la mayoría de los ovocitos en metafase II madurados in vitro (no sometidos a ningún tratamiento experimental) y analizados mediante microscopía confocal, presenta un huso de morfología normal. En contra de la hipótesis inicial en este estudio se ha determinado que la criopreservación de ovocitos en vesícula germinal no representa una ventaja respecto a la criopreservación de ovocitos en metafase II en lo que se refiere a la preservación de la integridad estructural del huso meiótico. La congelación tiene un efecto deletéreo sobre la estructura del huso meiótico de los ovocitos congelados en vesícula germinal, siendo la tasa de ovocitos con aberraciones estructurales del huso relativamente baja mientras que en un elevado porcentaje de ovocitos no se detectan microtúbulos de tubulina polimerizada. El efecto deletéreo de la congelación en los ovocitos criopreservados en este estadío afecta también a las carácterísticas morfológicas de los cromosomas y su distribución en la placa metafásica. La congelación tiene un efecto deletéreo sobre la estructura del huso meiótico de los ovocitos congelados en metafase II. Las anomalías incluyen un elevado porcentaje de ovocitos en los que no se detectan microtúbulos de tubulina polimerizada, y una tasa de ovocitos con aberraciones estructurales del huso relativamente baja. En los casos en que se observa ausencia del huso, los cromosomas forman un grupo no siempre ordenado y no se observan cromosomas aislados en el citoplasma.
Resum: The present work analyses the effect of a cryopreservation protocol (slow freezing-rapid thawing, using 1,2 popanediol and sucrose as cryoprotectant agents) frequently used for clinical purposes on the survival, in vitro maturation potential, and structure of the meiotic spindle of human oocytes, frozen in the germinal vesicle and metaphase II stage. In order to accomplish it the following partial objectives were stated: a) To develop and validate a study model from in vitro matured oocytes. This study demonstrated through cytogenetic and FISH analysis that oocyte in vitro maturation does not induce per se an increase in the aneuploidy rate, therefore in vitro matured oocytes are a valid study model. b) To determine the in vitro maturation potential of the oocytes in each experimental group. In vitro culture was performed in follicular fluid from hormonally stimulated follicles. No differences were observed either in the maturation rate of the oocytes or in the time of culture needed to reach metaphase II stage in each experimental group. c) To determine the survival rate of human oocytes frozen-thawed either in the germinal vesicle or metaphase II stage. The present study demonstrated that oocytes cryopreserved in the germinal vesicle stage are from the morphological point of view more resistant to cryoinduced injury than metaphase II stage oocytes. In both cases high survival rates are observed, similar to those already published in the literature. It has also been demonstrated that the cryopreservation process does not affect the potential of oocytes frozen in the germinal vesicle stage to reinitiate the meiotic progression to metaphase II, because neither differences in the time of culture required for polar body extrusion before and after cryopreservation, nor in the respective maturation rates were observed. d) To determine the structure of the meiotic spindle of human oocytes frozen either in the germinal vesicle or metaphase II stage, in comparison with that of unfrozen control oocytes. An immunocytochemical staining technique of the meiotic spindle was developed for that purpose. This study determined that the majority of the in vitro matured metaphase II control oocytes analyzed through confocal laser microscopy showed a normal spindle configuration. Against the initial hypothesis, this study showed that the cryopreservation in the germinal vesicle stage does not represent an advantage with respect to the cryopreservation in metaphase II stage in relation to the preservation of the meiotic spindle structure. The cryopreservation process has a deletereous effect on the meiotic spindle structure of oocytes frozen in the germinal vesicle stage, being the rate of structural abnormalities relatively low while there is a high percentage of oocytes that show absence of polimerized tubulin. The aformentioned deletereous effect affects also the appearance of the chromosomes and their distribution in the metaphase plate. The cryopreservation process has a deletereous effect on the meiotic spindle structure of oocytes frozen in metaphase II stage. Abnormalities include a high percentage of oocytes that show absence of polimerized tubulin and a relatively low rate of structural spindle abnormalities. In those cases were there was an absent spindle, chromosomes were found in a group not always organized, but no chromosomes isolated in the cytoplasm were observed.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament Biologia Cel·lular i Fisiologia, 2001
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
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Llengua: Castellà.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Criopreservació d'òrgans, teixits, etc. ; Oòcits ; Criopreservació
ISBN: 8468810398

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3739


68 p, 806.4 KB

103 p, 1.6 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



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