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Cultivo primario para el estudio de la función osteoblástica / Sílvia Ruiz Gaspà ; [directores: Adolfo Diez Pérez y Xavier Nogués Solán]
Ruiz Gaspà, Sílvia
Díez Pérez, Adolfo, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Medicina)
Nogués Solan, Xavier, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Medicina)

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2006
Resum: Introducción: Los cultivos de osteoblastos humanos obtenidos de explantes óseos son un buen modelo de estudio de la funcionalidad osteoblástica. Existe una elevada correlación entre la actividad celular que presentan los osteoblastos in vitro e in vivo (biopsias óseas). El cultivo primario de osteoblastos derivados de hueso trabecular es el mejor modelo para el estudio de anomalías intrínsecas de las células de pacientes con enfermedades metabólicas óseas. Las estatinas o inhibidores específicos del enzima HMG-CoA reductasa actúan inhibiendo la síntesis hepática de colesterol. Las estatinas son utilizadas para disminuir los niveles de colesterol y proporcionar una importante vía de abordaje en el tratamiento de la hiperlipidemia y arteriosclerosis. En los últimos años se ha visto que pueden tener efectos pleiotrópicos en el hueso. El objetivo del trabajo fue analizar la implicación de la funcionalidad osteoblástica en el metabolismo del hueso mediante cultivo primario de osteoblastos humanos. De esta manera el trabajo se ha separado en cuatro subestudios diferentes que tienen como columna vertebral el cultivo primario para el estudio de la función osteoblástica. Objetivos: Subestudio I: Análisis del cultivo primario de osteoblastos humanos y la línea tumoral MG-63 como modelo para el estudio de patologías metabólicas óseas y el efecto de factores reguladores y de fármacos en el hueso. Subestudio II: Estudio de la proliferación celular y de la expresión génica del sistema OPG/RANKL, los factores Cbfa1 y BMP-2, y el colágeno tipo 1 y la osteocalcina, en cultivo primario de osteoblastos de pacientes con osteoporosis posmenopáusica. Subestudio III: Análisis del efecto de la simvastatina y la atorvastatina sobre la proliferación celular y la expresión génica del BMP-2, el colágeno tipo 1 y la osteocalcina en osteoblastos humanos primarios normales y la línea celular MG-63. Subestudio IV: Estudio de la proliferación celular y de la expresión génica del colágeno tipo 1 y la osteocalcina en cultivo primario de osteoblastos de varones con osteoporosis idiopática. Metodología: Para el cultivo primario de osteoblastos humanos se utilizaron muestras de rodilla, de cabeza de fémur y de cresta ilíaca. Se extrajo el hueso trabecular y se troceó en explantes de 1mm3. Los explantes fueron lavados mediante agitación mecánica con una solución salina y depositados sobre una placa de Petri con medio completo suplementado con suero. Pasadas aproximadamente cuatro semanas el cultivo llegaba a la confluencia y en este momento, previamente a realizar experimentos se procedía a la caracterización de los osteoblastos mediante la detección de la actividad fosfatasa alcalina y la expresión génica de la osteocalcina, usando en ambos casos fibroblastos humanos primarios como control negativo. Para la cuantificación de la expresión de los genes analizados en cada subestudio se utilizó la técnica de la PCR a tiempo real. A partir de las células tratadas de forma específica en cada uno de los subestudios se realizó la extracción de RNA total utilizando el método del Trizol. Cada una de las muestras de RNA aislado se evaluó su integridad mediante un gel de agarosa y se cuantificó para la posterior reacción de retrotranscripción a partir de 1mg de RNA. Finalmente se cuantificaron los niveles de expresión génica mediante la PCR a tiempo real. Esta técnica consiste en monitorizar la reacción de PCR a medida que ésta tiene lugar. Se realizó mediante la tecnología TacMan que utiliza unas sondas fluorogénicas que permiten la detección de los productos de PCR específicos a medida que se van sintetizando. En esta técnica se marca un umbral de fluorescencia en un punto donde la reacción se encuentra en fase exponencial. El ciclo en el cual la reacción de amplificación atraviesa el umbral de fluorescencia se denomina Ct (Treshold Cycle) y depende de la cantidad de cDNApresente en la muestra. Resultados: Subestudio I: Todas las líneas de osteoblastos primarios utilizadas mostraron fenotipo osteoblástico ya que todas ellas presentaron actividad fosfatasa alcalina y expresaron el gen de la osteocalcina. Subestudio II: Se obtuvieron un total de 21 muestras procedentes de mujeres menopáusicas sometidas a intervención quirúrgica por prótesis de rodilla. Se separaron en dos grupos en función de patología osteoporótica siguiendo los criterios densitométricos de la OMS de -2. 5DS. Resultó un total de 9 muestras en el grupo de pacientes osteoporóticas y 12 muestras en el grupo de pacientes no osteoporóticas. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la proliferación celular entre los dos grupos. Se observó una disminución estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica y COL1A1 en el grupo de pacientes osteoporóticas. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica de OPG bajo el estímulo de vitamina D y 17?-estradiol. Subestudio III: Se observó una disminución estadísticamente significativa de la proliferación celular en los cultivos tratados con distintas concentraciones de simbastatina y atorvastatina en los osteoblastos primarios y en la línea celular MG-63. Se observó un aumento de la expresión génica de COL1A1, osteocalcina y BMP-2 en los osteoblastos primarios y en la línea celular MG-63. Subestudio IV: Se obtuvieron un total de 30 muestras procedentes de biopsia de cresta ilíaca de pacientes varones. Se separaron en dos grupos en función de patología osteoporótica siguiendo los criterios densitométricos de la OMS de -2. 5DS. Resultó un total de 14 muestras en el grupo de pacientes osteoporóticas y 16 muestras en el grupo de pacientes no osteoporóticas. Se observó una disminución estadísticamente significativa de la proliferación celular en las muestras del grupo de pacientes osteoporóticos. Se observó una tendencia a la disminución de la expresión génica de COL1A1 en condiciones basales y con vitamina D en el medio. Se observó una disminución estadísticamente significativa de los niveles de expresión génica de osteocalcina en presencia de vitamina D en las muestras del grupo de pacientes con osteoporosis. Conclusiones: Subestudio I: El cultivo primario de osteoblastos es un buen modelo para el estudio de patologías metabólicas óseas (como la osteoporosis) y del efecto de factores y fármacos en el hueso. Subestudio II: Los osteoblastos procedentes de pacientes con osteoporosis posmenopáusica tienen un defecto que afecta a la expresión de genes característicos de la función osteoblástica. Subestudio III: Las estatinas (simvastatina y atorvastatina) afectan a la función osteoblástica favoreciendo la diferenciación a través de la inhibición de la proliferación celular y el incremento de la expresión de genes característicos del osteoblasto diferenciado con elevada actividad secretora. Subestudio IV: Los osteoblastos procedentes de pacientes con osteoporosis masculina idiopática tienen un defecto que afecta a la proliferación celular y a la expresión de genes característicos de la función osteoblástica.
Resum: Introduction: Human osteoblast cultures obtained from bone explants are a good model for studying the osteoblastic function. A strong correlation exists between the osteoblast activity in vitro and in vivo (bone biopsies). The osteoblasts primary culture derived from trabecular bone is the best model for the study of cell intrinsic anomalies from patients with metabolic bone illnesses. Statins or specific HMG-CoA reductase inhibitors operate inhibiting the hepatic synthesis of cholesterol. Statins are used to reduce cholesterol levels and are an important way of approaching the treatment of hyperlipidemia and arteriosclerosis. In the last years, it has been demonstrated that they can have pleiotropic effects in the bone. The objectives of this work were to analyze the implications of the osteoblastic function in bone metabolism using human osteoblast primary cultures. The work has been separated in to four substudies that although combine different strategies all share the common backbone of using primary cultures to study the osteoblastic function. Objectives: Substudy I: Analysis of primary human osteoblasts and the tumoral cell line MG-63 culture as a model for the study of bone metabolic pathologies and the effect of regulatory factors and drugs in the bone. Substudy II: Study of the cell proliferation and gene expression of OPG/RANKL, the factors Cbfa1 and BMP-2, collagen type 1 and osteocalcin in osteoblasts primary cultures in patients with postmenopausal osteoporosis. Substudy III: Analysis of the effect of simvastin and atorvastin in cell proliferation and the gene expression of BMP-2, collagen type 1 and osteocalcin in normal primary human osteoblasts and in the cell line MG-63. Substudy IV: Study of the cell proliferation and the gene expression of collagen type 1 and osteocalcin in primary cultures of osteoblasts of men with idiopathic osteoporosis. Patients and methods: For the primary culture of human osteoblasts, knee, femur and iliac crest samples were used. The trabecular bone was extracted, and cut into explants of 1mm3. The explants were washed with a saline solution by mechanic agitation and then placed on a Petri dish with complete medium complemented with serum. After approximately four weeks the culture reached confluence, and before any experiments, the osteoblasts were characterized measuring alkaline phosphatase activity and the gene expression of osteocalcin, using, in both cases, primary human fibroblasts as a negative control. For the quantification of the expression of the analyzed genes in every substudy, real time PCR was used. The different cells evaluated in every substudy were treated by the Trizol method to extract the total RNA. The integrity and the quantity of every one of the RNA samples isolated were evaluated by agarose gel electrophoresis. 1?g of RNA was used for every retrotranscription. Finally, gene expression levels were quantified by real time PCR. This technique consists in monitorizing the PCR reaction at the same time as it takes place. It was carried out using the TacMan technology that use fluorescent probes that permit the detection of the specific PCR products the moment they have been synthesized. In this technique, a fluorescent threshold is determined at a point where the reaction is in its exponential phase. The cycle in which the amplification reaction reaches the fluorescent threshold is called Ct (Threshold cycle) and depends on the quantity of cDNA in the sample. Results: Substudy I: All the osteoblast primary cell lines used displayed osteoblastic phenotypes as all of them presented alkaline phosphatase activity and expressed the osteocalcin gene. Substudy II: 21 samples were obtained from menopausal women submitted to chirurgic intervention for knee prosthesis. They were separated into two groups depending on the osteoporotic pathology following densitrometric criteria. As a result, 9 samples of osteoporotic women and 12 samples of non osteoporotic women were obtained. No statistically relevant differences were observed between the cell proliferation of the two groups. Statistically significant decreases were observed in gene expression levels and COL1A1 in the osteoporotic group. Furthermore, a statistically significant difference was observed in the OPG gene expression post-stimulation with vitamin D and 17?estradiol. Substudy III: A statistically significant decrease was also observed in cell proliferation in the cultures treated with different concentrations of simbastatin and atorvastatin in primary osteoblasts and in the MG-63 cell line. An increase in COL1A1, osteocalcin and BMP-2 gene expression was observed in primary osteoblasts and in the MG-63 cell line before the addition of statins. Substudy IV: A total of 30 samples from iliac crest biopsies of male patients were obtained. They were separated in to two groups depending on the osteoporotic pathology following densitrometric criteria. As a result, a total of fourteen samples in the osteoporotic patient group and sixteen in the non osteoporotic group were obtained. A statistically significant decrease in cell proliferation in the samples of the ostheoporotic group was observed. A tendency to decrease was observed in COL1A1 gene expression in basal conditions and with vitamin D in the medium. A statistically significant decrease in the osteocalcin gene expression levels in the presence of vitamin D was observed in the samples of the group of osteoporotic patients. Conclusions: Substudy I: The primary culture of osteoclasts is a good model for the study of bone metabolic illnesses (like osteoporosis) and the effect of factors and drugs in the bone. SubstudyII: The osteoblasts coming from patients with postmenopausal osteoporosis have a defect that affects the expression of characteristic genes of the osteoblastic function. Substudy III: Statins (simvastin and atorvastin) affect the osteoblastic function favouring differentiation through the inhibition of cellular proliferation and the increase of the expression of genes characteristic of the differentiated osteoblast with elevated secretive activity. Substudy IV: Osteoblasts coming from patients with masculine idiopathic osteoporosis have a defect that affects cell proliferation and characteristic genes of the osteoblastic function.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral-Universitat Autònoma de Barcelona, Facultatde Medicina, Departament de Medicina, 2005
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
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Llengua: Castellà.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Cèl·lules òssies ; Cultiu cel·lular ; Ossos ; Metabolisme
ISBN: 8468988782

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/4486


194 p, 6.2 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-05



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