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Cloning, expression, purification and crystallisation of the human ets-1/usf1/dna complex & crystal structure of thermotoga maritima histidinol-phosphate aminotransferase (ec 2.6.1.9) / a dissertation presented by Francisco J. Fernández-Pérez ; [directors de la tesi: Enric Querol, Matthias Wilmanns]
Fernández Pérez, Francisco J.
Querol Murillo, Enrique, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular)
Wilmanns, Matthias, dir.

Publicació: Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2004
Resum: Ets-1 y USF1 son factores de transcripción implicados en muchos procesos fundamentales del desarrollo y la diferenciación celular. Defectos en su regulación se han asociado con desórdenes patológicos e infecciones virales. Ets-1, en particular, es un paradigma del mecanismo de regulación transcripcional en virtud del cual la capacidad de Ets-1 para unir DNA y, por tanto, de transactivación, están silenciadas constitutivamente (autoinhibición). La desrepresión de Ets-1 se puede lograr por medio de interacciones proteína-proteína, que desenmascaran el dominio de unión a DNA de Ets-1 y conducen a la formación de un complejo ternario de gran afinidad entre Ets-1, una proteína compañera y el sitio de unión combinado para ambos factores de transcripción. En este trabajo, emprendimos la elucidación estructural del mecanismo de autoinhibición de Ets-1. Comenzamos con la clonación, expresión y purificación de Ets-1 y las proteínas compañeras USF1 y MafB. A medida que íbamos enfrentando nuevos desafíos, diseñamos métodos y aproximaciones que facilitaran la producción eficaz de proteínas de unión a DNA para biología estructural. Uno de los conceptos fundamentales que ha reaparecido en el presente estudio es la necesidad de proporcionar a cada proteína un entorno lo mas parecido posible al que disfrutan en su contexto biológico. Por ejemplo, la estabilización de Ets-1 no fue posible hasta que se añadió el complejo USF1/DNA , que semeja las condiciones fisiológicas en las que USF1, unido a DNA, recluta Ets-1 sobre su sitio de unión. Hemos producido con éxito un conjunto de complejos ternarios Ets-1/USF1/DNA para los cuales hemos buscado condiciones de cristalización. Hemos obtenido cristales, que hemos probado contienen Ets-1, USF1 y DNA. El refinamiento (optimización) de esas condiciones de cristalización preliminares debería conducir en definitiva a la obtención de cristales de suficiente calidad para difracción. Estos cristales ofrecen la posibilidad de profundizar nuestro conocimiento en un mecanismo de regulación que tiene una importancia capital en enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o muchos tipos de leucemias.
Resum: Ets-1 and USF1 are transcription factors involved in many key processes in development and differentiation. Defects in their regulation have been associated with pathological disorders and viral infections. Furthermore, Ets-1 is a paradigm of a regulation mechanism in transcriptional control whereupon its DNA-binding activity and, thereby, its transactivation properties, are constitutively silenced (autoinhibition). Derepression of Ets-1 can be achieved by protein-protein interactions, which unmask Ets-1's DNA binding domain and lead to the formation of a high affinity ternary complex onto DNA between Ets-1, the partner protein and the combined site for both transcription factors. In this work, we undertook the structural elucidation of the autoinhibitory mechanism of Ets-1. We started off by cloning, expressing and purifying Ets-1 and the partner proteins USF1 and MafB. As new challenges were met in this part of the project, we devised methods and approaches directed towards the efficient production of DNA-binding proteins for structural biology. A key concept turn out to be the necessity to provide proteins with an environment closest to their biological contexts in order to stabilise them. For example, Ets-1 stabilisation could not be attained until a pre-formed USF1/DNA complex was added to it, resembling the in vivo situation, where USF1, bound to their composite binding site, recruits Ets-1 onto DNA. We successfully produced a number of Ets-1/USF1/DNA ternary complexes and have partially screened the vast space of crystallisation conditions. Crystals have been obtained, and they have been proved to contain both protein partners plus DNA. Refinement of these preliminary crystallisation conditions will ultimately render crystals of sufficient quality for diffraction experiments. We are excited about the possibilities open up by these crystal for deeper insight into a not well understood regulatory mechanism, but which underlies such important diseases as the human immunodeficiency syndrome and many different types of leukaemia.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2002
Nota: Consultable des del TDX
Nota: Títol obtingut de la portada digitalitzada
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Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis
Matèria: Clonatge molecular ; Gens ; Expressió ; Diferenciació cel·lular ; Transcripció genètica ; Regulació
ISBN: 8468878030

Adreça alternativa:: http://hdl.handle.net/10803/3508


90 p, 406.4 KB

41 p, 1.3 MB

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Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2009-05-07, darrera modificació el 2016-06-04



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