Development of Pichia pastoris for the production of human α-galactosidase A as a model lysosomal enzyme / Antonio Barreiro Vázquez ; [director: David Resina Rodríguez ; tutor: Pau Ferrer Alegre]
Barreiro Vázquez, Antonio
Resina Rodríguez, David, dir.
Ferrer i Alegre, Pau
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental

Publicación: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2016
Descripción: 1 recurs electrònic (255 p.)
Resumen: L'α-galactosidasa A humana (GLA) pertany a la família d'hidrolases lisosomals involucrades en malalties d'emmagatzemat enzimàtic (MEEs). Les teràpies de reemplaçament enzimàtic (TREs), basades en l'administració de l'enzim disfuncional, són una mesura eficient per alentir l'avanç d'algunes MEEs. Tanmateix, el cost de les TREs disponibles actualment es extremadament elevat. Per tant, es proposa com a solució l'ús de sistemes de producció alternatius. P. pastoris és un sistema prometedor per la producció de productes terapèutic biològics, tot i que el seu patró de glicosilació ha de ser adaptat per a aquest ús. GLA, involucrat en la malaltia de Fabry, és l'enzim seleccionat per Bioingenium per avaluar la viabilitat del llevat per produir hidrolases lisosomals, i en tal cas, per al seu ús com a proteïna model per a la modificació del patró de glicosilació P. pastoris. En primer lloc, es va avaluar l'expressió GLA recombinant (rhGLA) en diferents soques de P. pastoris. Un cop seleccionada la més adient, els nivells d'expressió és van millorar mitjançant la sobreexpressió de HAC1p, un activador transcripcional. A continuació, es va optimitzar la productivitat específica de rhGLA mitjançant el clonatge de múltiples còpies del gen codificant. En conjunt, es va aconseguir millorar 7 vegades la productivitat comparat amb els valors inicials. Addicionalment, es van expressar amb èxit variants de l'enzim amb tag, amb un domini d'internalització cel·lular, o mancat d'una seqüència C-terminal. En darrer lloc, es va obtenir un clon lliure de marcadors de resistència per al seu ús com a soca base per la modificació del patró de glicosilació. Es va establir un procés escalable de producció en bioreactor basat en condicions d'O2 limitant, permetent la producció d'elevades quantitats d'enzim. A més, es van desenvolupar mètodes cromatogràfics per a l'aïllament de rhGLA. En concret, s'ha descrit un procés basat en 3 passos cromatogràfics per la purificació de quantitats significants d'enzim lliure de tag, així com procediments de cromatografia d'afinitat per la purificació de petites quantitats de variants de rhGLA destinades a ser caracteritzades. Finalment, s'ha implementat un conjunt de tècniques per la caracterització de l'enzim, incloent anàlisis de glicans i assajos in vitro. Mitjançant l'ús de fibroblasts provinents d'un pacient de Fabry, s'ha pogut valorar amb simplicitat la eficiència d'internalització de l'enzim recombinant. Tal i com s'esperava, la rhGLA amb estructures de glicosilació pròpies de llevat va mostrar nivells d'internalització pobres. En general, s'ha demostrat que P. pastoris és un sistema d'expressió adequat per a la producció de rhGLA. Els mètodes desenvolupats en aquest treball són de gran valor per futures investigacions relacionades amb la humanització dels patrons de glicosilació de P. pastoris. A més, els resultats són d'utilitat per l'escalat dels processos de producció, que habilitaran el llevat per la producció de diferents enzims lisosomals destinats a l'ús en TREs.
Resumen: Human α-galactosidase A (GLA) belongs to the family of lysosomal hydrolases involved in lysosomal storage diseases (LSDs). Enzyme replacement therapies (ERTs), based on the administration of the recombinant missing enzyme, are an efficient measure to slow the advance of some LSDs. However, the cost of currently available ERTs is extraordinarily high. Therefore, the use of alternative production systems is proposed as a solution. P. pastoris is a promising system for the production of biopharmaceuticals, even though its glycosylation pattern needs to be engineered for such purpose. GLA, involved in Fabry disease, is the enzyme selected by Bioingenium to evaluate the feasibility of the yeast to produce human lysosomal hydrolases and, if so, to use it as the model protein in strain glycoengineering. First, the expression of recombinant human GLA (rhGLA) in P. pastoris was evaluated in different strains. Once selected the most suitable one, the expression levels were significantly improved by overexpression of HAC1p, a transcriptional activator. Then, the specific productivity of rhGLA was optimized by cloning multiple copies of the coding gene. Overall, the productivity was improved about 7-fold compared to the initial. Additionally, variants of the enzyme containing a tag, a cell internalization motif or lacking a C-terminal sequence were successfully expressed. Lastly, a markerless clone expressing rhGLA was generated for its use as a base strain for glycan modification. A scalable bioreactor process based on O2-limiting conditions has been established for the production of high quantities of the enzyme. Moreover, purification methods have been developed for the isolation rhGLA. Specifically, a 3-step chromatography process is described for the purification of significant amounts of untagged enzyme, while affinity-chromatography procedures were defined for the fast isolation of small amounts of rhGLA variants aimed for product characterization. Finally, a set of analytical methods have been implemented for the characterization of rhGLA, including glycan analysis and in vitro assays. By using fibroblasts from a Fabry patient, the uptake efficiency of the recombinant enzyme could be easily assessed. As expected, the rhGLA having yeast-like glycans showed poor internalization levels. Overall, P. pastoris has been shown as a suitable production system for rhGLA. The methods developed in this work are of great value for future strain glycoengineering and production scale-up, which will ultimately qualify the yeast for the production of different lysosomal enzymes for ERTs.
Nota: Bibliografia
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental, 2016
Derechos: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Lengua: Anglès.
Documento: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Materia: Pichia Pastoris ; Alfa-galactosidasa ; Lisosomes ; Hidrolases

Adreça alternativa: https://hdl.handle.net/10803/382822


256 p, 4.4 MB

El registro aparece en las colecciones:
Documentos de investigación > Tesis doctorales

 Registro creado el 2016-10-25, última modificación el 2019-02-02



   Favorit i Compartir