| Publicación: |
[Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2020. |
| Descripción: |
1 recurs en línia (173 pàgines) |
| Resumen: |
Les factories cel·lulars microbianes poden ser utilitzades per produir un ampli rang de bioproductes d'interès per a la biotecnologia industrial, els quals comprenen principalment la producció de proteïnes recombinants i metabòlits. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emergeix com un hostatger prometedor per a la producció de proteïna recombinant (RPP) ja que comparteix moltes característiques amb Saccharomyces cerevisiae, però, mostra avantatges en relació amb el consum d'oxigen, tenir un patró de glicosilació més simple, i una menor secreció de proteïnes endògenes. Per aquestes raons, s'han realitzat grans esforços amb l'objectiu d'optimitzar l'eficiència d'aquest hostatger, els quals poden agrupar-se en dos principals i complementaris enfocaments: l'enginyeria de soques i bioprocés. La present tesi doctoral es va basar en l'ús de tots dos enfocs per tal de millorar bioprocessos de producció de lipases recombinants amb interès industrial. En primer lloc, es va demostrar la importància del coneixement de les cinètiques de producció com una potent eina per al disseny d'estratègies òptimes en la RPP a través de la caracterització de dos clons amb un diferent comportament, a causa de la seva diferent dosi gènica, expressant la lipasa 1 de Candida rugosa sota la regulació del promotor GAP (PGAP) duent a terme cultius en quimiòstat i fed-batch. Els resultats, també justificats mitjançant anàlisi transcripcional de diversos gens clau com important novetat, van demostrar que la cinètica de producció depèn de les característiques intrínseques de cada clon usat. D'aquesta manera, la selecció d'una μ adequada per a cada cas permet, d'una manera diferent, un desenvolupament racional del procés per poder optimitzar els bioprocessos RPP. Després, es va avaluar la potencial implementació de la deprivació de carboni (carbon-starving) com una innovadora estratègia que millori les velocitats de producció i rendiments de Crl1 en cultius fed-batch amb una prèvia caracterització fisiològica per a cultius en quimiòstat. Els resultats van evidenciar que l'efecte positiu d'utilitzar aquesta estratègia és altament depenent de les particularitats intrínseques del clon utilitzat. Es va realitzar una anàlisi transcripcional addicional (RNAseq) sobre mostres de quimiòstat, ressaltant la diferència en la transcripció per a tots els gens del llevat. A més, el comportament del bioprocés durant l'ús de promotor GAP (PGAP) es va comparar amb la utilització del promotor induïble AOX1 (PAOX1) duent a terme cultius en quimiòstat per a la producció de Crl1. Tot i que en el cas del PAOX1 es va apreciar una major producció, s'hauria de considerar una avaluació econòmica prèvia a l'escalat del bioprocés, tenint en compte els nombrosos inconvenients de l'ús de metanol com a substrat. Finalment, seguint l'enfocament de l'enginyeria de soques, es va caracteritzar l'ús de dos nous promotors independents de l'ús de metanol sobre l'expressió de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) com una poderosa eina que permeti explotar el potencial de P. pastoris a la RPP. Tots dos promotors van mostrar molt millors resultats en comparació als obtinguts amb el PGAP tot i que els patrons de producció entre els promotors va ser significativament diferent per a cada cas. En resum, els resultats mostrats al llarg dels diferents capítols de la present tesi reforcen la utilitat de l'enginyeria de bioprocessos i de soques a través dels diferents estudis realitzats, els quals van permetre obtenir millores significatives en l'eficiència de la RPP. El coneixement dels factors clau involucrats en l'expressió recombinant obre una àmplia finestra de noves oportunitats que fan possible que P. pastoris s'estableixi com una plataforma robusta per a la RPP, mostrant-se altament competitiva enfront dels sistemes convencionals. |
| Resumen: |
Las factorías celulares microbianas pueden ser utilizadas para producir un amplio rango de bioproductos de interés para la biotecnología industrial, los cuales comprenden principalmente la producción de proteínas recombinantes y metabolitos. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emerge como un hospedero prometedor para la producción de proteína recombinante (RPP) debido a que comparte muchas características con Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, muestra ventajas en relación con el consumo de oxígeno, tener un patrón de glicosilación más simple, y una menor secreción de proteínas endógenas. Por estas razones, se han realizado grandes esfuerzos con el objetivo de optimizar la eficiencia de este hospedero, los cuales pueden agruparse en dos principales y complementarios enfoques: la ingeniería de cepas y bioproceso. La presente tesis doctoral se basó en el uso de ambos enfoques para mejorar bioprocesos de producción de lipasas recombinantes con interés industrial. En primer lugar, se demostró la importancia del conocimiento de las cinéticas de producción como una potente herramienta para el diseño de estrategias óptimas en la RPP a través de la caracterización de dos clones con un diferente comportamiento, debido a su diferente dosis génica, expresando la lipasa 1 de Candida rugosa bajo la regulación del promotor GAP (PGAP) llevando a cabo cultivos en quimiostato y fed-batch. Los resultados, también justificados mediante análisis transcripcional de varios genes clave como importante novedad, demostraron que la cinética de producción depende de las características intrínsecas de cada clon usado. De esta manera, la selección de una µ adecuada para cada caso permite, de una manera diferente, un desarrollo racional del de proceso para poder optimizar los bioprocesos RPP. Después, se evaluó la potencial implementación de la deprivación de carbono (carbon-starving) como una innovadora estrategia que mejore las velocidades de producción y rendimientos de Crl1 en cultivos fed-batch con una previa caracterización fisiológica para cultivos en quimiostato. Los resultados evidenciaron que el efecto positivo de utilizar esta estrategia es altamente dependiente de las particularidades intrínsecas del clon utilizado. Se realizó un análisis transcripcional adicional (RNAseq) sobre muestras de quimiostato, resaltándose la diferencia en la transcripción para todos los genes de la levadura. Además, el comportamiento del bioproceso durante el uso del promotor GAP (PGAP) se comparó con la utilización del promotor inducible AOX1 (PAOX1) llevando a cabo cultivos en quimiostato para la producción de Crl1. Aunque en el caso del PAOX1 se apreció una mayor producción, se debería considerar una evaluación económica previa al escalado del bioproceso, considerando los numerosos inconvenientes del uso de metanol como sustrato. Finalmente, siguiendo el enfoque de la ingeniería de cepas, se caracterizó el uso de dos nuevos promotores independientes del uso de metanol sobre la expresión de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) como una poderosa herramienta que permita explotar el potencial de P. pastoris en la RPP. Ambos promotores mostraron mucho mejores resultados en comparación a los obtenidos con el PGAP aunque los patrones de producción entre los promotores fue significativamente diferente para cada caso. En resumen, los resultados mostrados a lo largo de los diferentes capítulos de la presente tesis refuerzan la utilidad de la ingeniería de bioprocesos y de cepas a través de los diferentes estudios realizados, los cuales permitieron obtener mejoras significativas en la eficiencia de la RPP. El conocimiento de los factores clave involucrados en la expresión recombinante abre una amplia ventana de nuevas oportunidades que hacen posible que P. pastoris se establezca como una plataforma robusta para la RPP, mostrándose altamente competitiva frente a los sistemas convencionales. |
| Resumen: |
Microbial cell factories can be used to produce a wide range of bioproducts of interest for the biotechnological industry, which comprises mainly the production of recombinant proteins and metabolites. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emerges as a promising host for recombinant protein production (RPP) due to it shares many features with Saccharomyces cerevisiae, however, displays some advantages in terms of oxygen consumption, simpler glycosylation pattern, and lower endogenous protein secretion. For these reasons, great efforts have been performed with the objective to optimize the efficiency of this host which can be grouped in two main and complementary approaches: the strain and bioprocess engineering. The present PhD thesis was focused in the use of both approaches, in order to improve the production bioprocess of recombinant lipases with industrial interest. At first, it was demonstrated the importance of the knowledge of production kinetics as strong tool to design optimal strategies for RPP through the characterization of two clones with contrasting production performance, due to its different gene dosage, expressing Candida rugosa lipase 1 (Crl1) regulated under GAP promoter (PGAP) using chemostat and fed-batch cultures. The results, also supported by transcriptional analysis of some target genes as marked novelty, demonstrated that production kinetics depends on the intrinsic characteristics of each clone used. Therefore, the selection of adequate µ for each case enables, in a different way, the rational process development to optimize RPP bioprocesses. Later, it was also evaluated the potential implementation of carbon-starving as innovative strategy to enhance the Crl1 production rates and yields on fed-batch cultures with a previous physiological characterization on chemostat cultivation. Results showed that positive effects observed using this strategy are highly dependent on the specific features of the clone used. An additional transcriptomic analysis (RNAseq) was carried out with chemostat samples, pointing out the difference on the transcription of all the genes of the yeast. In addition, bioprocess performance of the GAP promoter (PGAP) was compared with the inducible AOX1 promoter (PAOX1) by carrying out chemostat cultures producing Crl1. Although PAOX1 displayed higher production, an economical evaluation should be necessary before scale-up of the bioprocess, considering the numerous drawbacks of using methanol as substrate. Finally, following the strain engineering approach, it was characterized the use of two alternative methanol free novel promoters on the expression of lipase B from Candida antarctica (CalB) as strong tool that allows to exploit P. pastoris potential on RPP. Both promoters displayed much better production parameters than the observed with PGAP although the production pattern between promoters were significantly different on each case. Overall, the results presented along the different chapters of this current thesis support the usefulness of bioprocess and strain engineering through the different studies performed, which gave significant improvements in RPP efficiency. The knowledge of key factors involved on recombinant expression opens a window of new opportunities that allows P. pastoris to be established as a robust platform for RPP and showing it as highly competitive to conventional systems. |
| Nota: |
Departament responsable de la tesi: Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental. |
| Nota: |
Tesi. Doctorat. Universitat Autònoma de Barcelona. 2020. |
| Derechos: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, i la comunicació pública de l'obra, sempre que no sigui amb finalitats comercials, i sempre que es reconegui l'autoria de l'obra original. No es permet la creació d'obres derivades.  |
| Lengua: |
Anglès |
| Documento: |
Tesi doctoral ; Versió publicada |
| Materia: |
Control de processos biotecnològics ;
Pichia pastoris ;
Proteïnes recombinants |
visitante ::
identificación
