| Fecha: |
2022 |
| Resumen: |
La necessitat de tenir accés a eines per diagnosticar una malaltia ràpidament s'ha fet cada cop més evident, especialment després de la pandèmia provocada pel virus SARS-CoV-2. Actualment la majoria d'anàlisis els fa personal tècnic en laboratoris especialitzats, de manera que entre la presa de la mostra i l'obtenció dels resultats passen com a mínim 48h. Aquest retard dificulta prendre decisions i mesures de forma ràpida per actuar en conseqüència. Disposar d'eines d'anàlisis ràpides, robustes i que es puguin utilitzar al mateix lloc on s'atén al pacient (point-of-care) és una millora considerable de cara al diagnòstic i seguiment d'una malaltia. Algunes d'aquestes eines ja estan disponibles al mercat, com ara el test d'embaràs, el de detecció de glucosa per a diabètics o el de SARS-CoV-2. Aquests dispositius però, només permeten implementar protocols d'anàlisis molt simples que no requereixin la manipulació de gaires reactius ni constin de moltes etapes, o bé el resultat que se n'obté no és quantitatiu, fet que en limita l'ús per a determinades aplicacions on es requereix la quantificació de la mostra. El desenvolupament de dispositius (lab-on-a-chip) que permetin suplir aquestes carències, passa per incloure altres elements, com ara sistemes de detecció més precisos o sistemes per bombejar els fluids o per gestionar la circulació de múltiples reactius (e. g. vàlvules). Però per integrar-los en plataformes que siguin compactes i portables primer cal miniaturitzar-los, ja que actualment la gran majoria depenen d'elements externs voluminosos que impedeixen utilitzar-los in-situ. Aquesta tesis parteix de la tecnologia de vàlvules de cera integrades en dispositius lab-on-a-chip desenvolupada prèviament al Grup de Transductors Químics de l'Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM, CSIC). Primerament aquestes vàlvules s'actuaven elèctricament, però se'n va adaptar l'actuació per polsos de llum LED, ja que permetia simplificar la interfície i desenvolupar una plataforma potencialment més compacta. La tesis se centra en adaptar la tecnologia per integrar les vàlvules en xips microfluídics fabricats per tècniques de prototipatge ràpid. Aprofitant els avantatges que confereixen aquestes vàlvules, s'ha desenvolupat un instrument portable, per a automatitzar el funcionament dels xips, que integra un sistema de bombeig i un sistema de mesura de l'absorbància. A banda d'això, la plataforma s'ha adaptat per desenvolupar assajos d'afinitat amb marcatge enzimàtic del tipus ELISA sandvitx (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Per dur a terme aquests assajos s'ha incorporat una fase sòlida al xip sobre la qual s'han immobilitzat les molècules de captura. S'ha avaluat el comportament fluídic de tres fases sòlides diferents: microesferes de poliestirè, nitrocel·lulosa i vidre. Posteriorment, s'han posat apunt un assaig del tipus ELISA sandvitx (sobre nitrocel·lulosa) i un assaig de tipus ELONA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay) (sobre vidre). Els assaigs s'han optimitzat en xips sense vàlvules i utilitzant una bomba de xeringa comercial per garantir un control ideal dels paràmetres fluídics. El primer assaig es basa en la detecció del factor de necrosis tumoral alpha (TNFα), una proteïna pro-inflamatòria que participa, juntament amb altres citoquines, en la resposta del sistema immunitari. És una proteïna àmpliament utilitzada com a biomarcador per estudiar la resposta antiinflamatòria front a diverses malalties. El segon assaig està pensat per detectar la seqüència d'ARNr 16S d'Escherichia coli a través de la interacció d'aquesta amb seqüències complementàries, en un format d'assaig del tipus ELONA. E. coli és un dels bacteris més comuns causants d'infeccions, tant en humans com en animals. Per això és un bon indicador d'interès en àmbits com la medicina, la indústria alimentària o el medi ambient. S'ha demostrat la viabilitat de realitzar immunoassajos automatitzats, encara que s'han detectat necessitats de millora en el disseny que caldria solucionar per tal de poder explotar al màxim el potencial de la plataforma desenvolupada. |
| Resumen: |
La necesidad de tener acceso a herramientas para diagnosticar una enfermedad rápidamente es cada vez más evidente, especialmente después de la pandemia provocada por el virus SARS-CoV-2. Actualmente la mayoría de análisis los hace personal técnico en laboratorios especializados, de forma que entre la toma de la muestra y la obtención de los resultados transcurren como mínimo 48h. Este retraso dificulta tomar decisiones y medidas con rapidez para actuar en consecuencia. Disponer de herramientas de análisis rápidas, robustas y que se puedan utilizar en el mismo lugar de atención al paciente (point-of-care) es una mejora considerable para el diagnóstico y seguimiento de una enfermedad. Algunas de estas herramientas ya están disponibles en el mercado, como el test de embarazo, el de detección de glucosa para diabéticos o el de SARS-CoV-2. Pero estos dispositivos solo permiten implementar protocolos de análisis simples que no requieran la manipulación de muchos reactivos ni consten de muchas etapas, o bien el resultado que se obtiene no es cuantitativo, lo que limita su uso para determinadas aplicaciones donde se requiere la cuantificación de la muestra. El desarrollo de dispositivos (lab-on-a-chip) que permitan suplir estas carencias, pasa por incluir otros elementos, como sistemas de detección más precisos o sistemas de bombeo de fluidos o de gestión de la circulación de múltiples reactivos (e. g. válvulas). Pero para integrarlos en plataformas que sean compactas y portables primero hay que miniaturizarlos, ya que la gran mayoría depende de elementos externos voluminosos que impiden su uso in-situ. Esta tesis parte de la tecnología de válvulas de cera integradas en dispositivos lab-on-a-chip desarrollada previamente en el Grup de Transductors Químics del Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM, CSIC). Estas válvulas se actuaban eléctricamente, pero se adaptó la actuación por pulsos de luz LED, ya que permitía simplificar la interfaz y desarrollar una plataforma potencialmente más compacta. La tesis se centra en adaptar la tecnología para integrar las válvulas en chips microfluídicos fabricados por técnicas de prototipado rápido. Aprovechando las ventajas que confieren estas válvulas, se ha desarrollado un instrumento portable para automatizar el funcionamiento de los chips que integra un sistema de bombeo y un sistema de medida de la absorbancia. Además, la plataforma se ha adaptado para desarrollar ensayos de afinidad con marcaje enzimático del tipo ELISA sándwich (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Para realizar estos ensayos se ha incorporado una fase sólida dentro del chip sobre la cual se han inmovilizado las moléculas de captura. Se ha evaluado el comportamiento fluídico de tres fases sólidas diferentes: microesferas de poliestireno, nitrocelulosa y vidrio. Se han puesto a punto un ensayo del tipo ELISA sándwich (sobre nitrocelulosa) y un ensayo del tipo ELONA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay) (sobre vidrio). Los ensayos se han optimizado en chips sin válvulas y utilizando una bomba de jeringa comercial para garantizar un control ideal de los parámetros fluídicos. El primer ensayo se basa en la detección del factor de necrosis tumoral alpha (TNFα), una proteína pro-inflamatoria ampliamente usada como biomarcador para estudiar la respuesta antiinflamatoria frente a varias enfermedades. El segundo ensayo está pensado para detectar la secuencia de ARNr 16S de Escherichia coli mediante la interacción de esta con secuencias complementarias, en un formato de ensayo del tipo ELONA. E. coli es una de las bacterias más comunes causantes de infecciones, tanto en humanos como en animales. Por eso es un buen indicador de interés en ámbitos como la medicina, la industria alimentaria o el medio ambiente. Se ha demostrado la viabilidad de realizar inmunoensayos automatizados, aunque se han detectado necesidades de mejora del diseño que deberían solucionarse para poder explotar al máximo el potencial de la plataforma desarrollada. |
| Resumen: |
Recently, having access to tools to diagnose a disease in a rapid way has become of great importance, especially after the pandemic caused by SARS-CoV-2 virus. Currently, the vast majority of analysis are carried out by technicians in specialized labs. In this way, the span time between the sampling and the results is at least 48h. This delay hinders the possibility to act rapidly and accordingly to the results obtained. Therefore, having fast and robust analysis tools that could be used at the same point-of-care is a considerable improvement in the diagnosis and monitoring of a disease. Some of these tools are already available in the market, like for example the pregnancy test, the test for glucose detection for diabetic patients or the SARS-CoV-2 test. However, only simple analysis, that require few reagents and steps, can be done with these devices. Moreover, the obtained result is often non-quantitative, which limits the use of these devices to the applications where no quantification is required. The development of lab-on-a-chip devices to overcome these limitations requires to miniaturize and incorporate other elements, like more precise detection systems or fluid handling systems (e. g. valves and pumps). Nevertheless, the majority of these devices rely on bulky elements that restrict its use in-situ. This thesis is based on the wax valve technology previously developed by the Grup de Transductors Químics of Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM, CSIC). The first valves were electrically actuated, but finally they were adapted to be controlled by LED light pulses which enables to simplify the interface and develop a potentially more compact platform. Taking these valves as the starting point, the thesis is focused on adapting the technology to integrate them into microfluidic chips fabricated by rapid prototyping techniques. In addition, taking advantage of the benefits of these valves, a portable instrument to automate the use of the chips, that incorporates a pumping system and an absorbance measurement system, has been developed. A part from that, the platform has been adapted to develop ELISA-like (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) affinity assays with enzymatic labelling. To perform those assays, a solid phase, in which the capture molecules have been immobilized, is incorporated inside the chip. The fluidic behaviour of three different solid phases has been studied: polystyrene microspheres, nitrocellulose and glass. Later, an ELISA sandwich like assay (onto nitrocellulose) and an ELONA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay) (onto glass) have been implemented on-chip. To optimize the assays, chips without valves and a commercial syringe pump have been used to guarantee the ideal control of fluidic parameters. The first assay is based on the detection of tumour necrosis factor alpha (TNFα), a pro-inflammatory protein widely used as a biomarker to study the anti-inflammatory response to various diseases. The second assay is based on the detection of 16S rRNA sequence of Escherichia coli by the interaction between this sequence with complementary ones in an ELONA like assay. E. coli is one of the most common bacteria causing infections, both in humans and animals. That is why it is a good indicator of interest in areas like medicine, the food industry or the environment. The viability to perform automatic immunoassays has been demonstrated although some needs for design improvements have been detected which should be addressed in order to maximize the potential of the developed platform. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Ciència dels Aliments |
| Derechos: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, i la comunicació pública de l'obra, sempre que no sigui amb finalitats comercials, i sempre que es reconegui l'autoria de l'obra original. No es permet la creació d'obres derivades.  |
| Lengua: |
Castellà |
| Colección: |
Programa de Doctorat en Ciència dels Aliments |
| Documento: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Materia: |
Lab-On-A-Chip ;
Elisa ;
Vàlvules microfluídiques ;
Válvulas microfluídicas ;
Microfluidic valves ;
Ciències Experimentals |
visitante ::
identificación
dir.
