A Rewired NADPH-Dependent Redox Shuttle for Testing Peroxisomal Compartmentalization of Synthetic Metabolic Pathways in Komagataella phaffii
Fina Romero, Albert (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Àvila-Cabré, Sílvia (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Vázquez Pereira, Enrique (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Albiol i Sala, Joan (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Ferrer, Pau (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)

Date:	2025
Abstract:	The introduction of heterologous pathways into microbial cell compartments offers several potential advantages, including increasing enzyme concentrations and reducing competition with native pathways, making this approach attractive for producing complex metabolites like fatty acids and fatty alcohols. However, measuring subcellular concentrations of these metabolites remains technically challenging. Here, we explored 3-hydroxypropionic acid (3-HP), readily quantifiable and sharing the same precursors-acetyl-CoA, NADPH, and ATP-with the above-mentioned products, as a reporter metabolite for peroxisomal engineering in the yeast Komagataella phaffii. To this end, the malonyl-CoA reductase pathway for 3-HP production was targeted into the peroxisome of K. phaffii using the PTS1-tagging system, and further tested with different carbon sources. Thereafter, we used compartmentalized 3-HP production as a reporter system to showcase the impact of different strategies aimed at enhancing the peroxisomal NADPH pool. Co-overexpression of genes encoding a NADPH-dependent redox shuttle from Saccharomyces cerevisiae (IDP2 / IDP3) significantly increased 3-HP yields across all substrates, whereas peroxisomal targeting of the S. cerevisiae NADH kinase Pos5 failed to improve 3-HP production. This study highlights the potential of using peroxisomal 3-HP production as a biosensor for evaluating peroxisomal acetyl-CoA and NAPDH availability by simply quantifying 3-HP, demonstrating its potential for peroxisome-based metabolic engineering in yeast.
Grants:	Agencia Estatal de Investigación PID2019-104666GB-I00 Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca 2021/SGR-00143 Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca 2021/FIB-00742 Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca 2021/FISDU-00399 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades FPU17/05434
Rights:	Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, fins i tot amb finalitats comercials, sempre i quan es reconegui l'autoria de l'obra original.
Language:	Anglès
Document:	Article ; recerca ; Versió publicada
Subject:	Peroxisome ; Metabolic engineering ; 3-hydroxypropionic acid ; Pichia pastoris ; Komagataella phaffii ; Acetyl-coa ; NADPH ; Redox shuttle
Published in:	Microorganisms, Vol. 13, Issue 1 (January 2025) , art 46, ISSN 2076-2607

DOI: 10.3390/microorganisms13010046
PMID: 39858813

15 p, 1.5 MB

The record appears in these collections:
Articles > Research articles
Articles > Published articles