| Data: |
2025 |
| Resum: |
La paraparèsia espàstica hereditària de tipus 52 (SPG52) és un trastorn neurològic ultra-rar caracteritzat per feblesa i espasticitat en les extremitats inferiors, retard del desenvolupament, discapacitat intel·lectual, convulsions i reducció del gruix del cos callós (CC). La SPG52 és causada per mutacions bial·lèliques en el gen AP4S1, que codifica la subunitat sigma del complex proteic adaptador 4 (AP-4). Mutacions en qualsevol de les subunitats del complex AP-4 provoquen la seva desestabilització i degradació, donant lloc a una fisiopatologia i simptomatologia comunes conegudes com a paraparèsia espàstica hereditària associada al complex AP-4. La funció exacta del complex AP-4 en la cèl·lula no està totalment definida però es creu que facilita la biogènesi dels autofagosomes mitjançant la classificació i el transport d'ATG9A. En l'actualitat, no existeix cura ni tractament per a la malaltia. Per tant, un enfocament de teràpia gènica destinat a restaurar l'expressió del gen AP4S1 representa una estratègia racional. Aquesta tesi doctoral presenta el desenvolupament de dos models per a avaluar l'eficàcia i la seguretat de la teràpia gènica proposada, que empra un vector viral adenoassociat. En concret, s'ha establert un model in vivo, concretament el primer model murí per a la SPG52, que presenta una eliminació completa del gen AP4S1 (AP4S1 KO). A més, s'ha desenvolupat un model in vitro mitjançant la generació de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC) derivades de biòpsies de pell d'una pacient i dos controls, amb la finalitat de produir neurones corticals derivades d'iPSC per a crear un model rellevant per a la malaltia humana. Després de la generació i caracterització satisfactòries de les neurones corticals derivades d'iPSC, les neurones derivades de pacients mostren una acumulació del cargo principal del complex AP-4, ATG9A, dins de la xarxa del trans-Golgi. A més, s'observen anomalies en la morfologia de les neurites i una reducció de l'activitat de la xarxa neuronal. La sobreexpressió del gen AP4S1 restableix amb èxit la formació del complex, millorant així el fenotip neuropatològic. Paral·lelament, es va dur a terme la generació, establiment i caracterització del model de ratolí AP4S1 KO. Aquest model animal reprodueix eficaçment la reducció del gruix del CC que presenten el 94% dels pacients amb SPG52. A més, els ratolins KO mostren reduccions en el pes corporal, la força muscular, la coordinació motora i l'esperança de vida en comparació amb ratolins sans no modificats genèticament (WT). Els dèficits neuromusculars identificats en la musculatura de les extremitats posteriors dels ratolins KO es van corroborar mitjançant avaluacions de la funció neuromuscular, que demostren una disminució del potencial d'acció muscular compost (CMAP). A més, els ratolins KO mostren diferències de comportament respecte als ratolins WT, com un augment del comportament exploratori sense signes d'ansietat, tal com s'observa en els pacients. Per avaluar l'eficàcia de l'enfocament de teràpia gènica proposada, es va administrar a dues cohorts d'animals un vector viral adenoassociat AAV9P31 que conté una còpia correcta del gen AP4S1 humà. Una cohort va rebre el tractament durant l'etapa neonatal, mentre que la segona cohort va ser tractada durant l'edat adulta primerenca. Es va avaluar la recuperació del fenotip en totes dues cohorts, la qual cosa va demostrar una restauració completa de la integritat del CMAP i el CC, una recuperació parcial de la reducció del gruix del CC, la coordinació motora i la força muscular; però, no es va observar cap efecte en el pes corporal dels animals. Aquests prometedors resultats estableixen les bases per als assajos de seguretat, augmentant les perspectives d'iniciar assajos clínics pel tractament de la SPG52. |
| Resum: |
La paraparesia espástica hereditaria de tipo 52 (SPG52) es un trastorno neurológico ultra-raro caracterizado por debilidad y espasticidad en las extremidades inferiores, retraso del desarrollo, discapacidad intelectual, convulsiones y reducción del grosor del cuerpo calloso (CC). La SPG52 está causada por mutaciones bialélicas con pérdida de función en el gen AP4S1, que codifica la subunidad sigma del complejo proteico adaptador 4 (AP-4). Alteraciones en cualquiera de las subunidades del complejo AP-4 provocan su desestabilización y degradación, resultando en una fisiopatología y sintomatología comunes, conocidas como la paraparesia espástica hereditaria asociada al complejo AP-4. La función exacta del complejo AP-4 en la célula todavía no está totalmente definida, pero se cree que facilita la biogénesis de los autofagosomas mediante la clasificación y el transporte de ATG9A. Actualmente, no existe cura ni tratamiento para esta enfermedad. Por ello, un enfoque basado en la terapia génica destinada a restaurar la expresión del gen AP4S1 es una estrategia racional. Esta tesis doctoral presenta el desarrollo de dos modelos para evaluar la eficacia y la seguridad de la terapia génica propuesta, en la que se emplea un vector viral adenoasociado. Se ha establecido un modelo in vivo, concretamente el primer modelo murino para la SPG52, con una eliminación completa del gen AP4S1 (AP4S1 KO). Además, se ha desarrollado un modelo in vitro mediante la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de biopsias de piel de una paciente y dos controles, con el fin de crear un modelo relevante para la enfermedad humana. Tras la generación y caracterización satisfactorias de las neuronas corticales derivadas de iPSC, las neuronas derivadas de pacientes muestran una acumulación del cargo principal del complejo AP-4, ATG9A, dentro de la red del trans-Golgi. Además, se observan anomalías en la morfología de las neuritas y una reducción de la actividad de la red neuronal. La sobreexpresión del gen AP4S1 reestablece la formación del complejo, mejorando así el fenotipo neuropatológico. Paralelamente, se llevó a cabo la generación, establecimiento y caracterización del modelo de ratón AP4S1 KO. Este modelo animal reproduce eficazmente la reducción del grosor del CC que tienen el 94 % de los pacientes con SPG52. Además de este fenotipo, los ratones KO muestran reducciones en el peso corporal, la fuerza muscular, la coordinación motora y la esperanza de vida en comparación con ratones sanos no modificados genéticamente (WT). Los déficits neuromusculares identificados en la musculatura de las extremidades posteriores de los ratones KO se corroboraron mediante evaluaciones de la función neuromuscular, que demuestran una disminución del potencial de acción muscular compuesto (CMAP). Además, los ratones KO mostraron diferencias de comportamiento con respecto a los ratones WT, como un aumento del comportamiento exploratorio sin signos de ansiedad, como se observa en los pacientes. Para evaluar la eficacia del enfoque de terapia génica propuesta, se administró a dos cohortes de animales un vector viral adenoasociado AAV9P31 que porta una copia correcta del gen AP4S1 humano. Una cohorte recibió el tratamiento durante la etapa neonatal, mientras que la segunda cohorte fue tratada durante la edad adulta temprana. Se evaluó la recuperación del fenotipo en ambas cohortes, lo que demostró una restauración completa de la integridad del CMAP y el CC, una recuperación parcial de la reducción del grosor del CC, la coordinación motora y la fuerza muscular; sin embargo, no se observó ningún efecto en el peso corporal de los animales. Estos prometedores resultados sientan las bases para los ensayos de seguridad, aumentando las perspectivas de iniciar ensayos clínicos para el tratamiento de la SPG52. |
| Resum: |
Hereditary spastic paraplegia type 52 (SPG52) is an ultra-rare neurological disorder characterized by weakness and spasticity in the lower limbs, developmental delay, intellectual disability, seizures, and thinning of the corpus callosum (CC). SPG52 is caused by biallelic loss-of-function mutations in the AP4S1 gene, which encodes the sigma subunit of the adaptor protein complex 4 (AP-4). Disruptions in any subunit of the AP-4 complex lead to its destabilization and degradation, resulting in a shared pathophysiology and symptomatology, known as the AP-4 complex associated hereditary spastic paraplegia. Although the exact role of the AP-4 complex remains undefined, it is hypothesized to facilitate the biogenesis of autophagosomes through the sorting and trafficking of ATG9A. At present, no cure or disease-modifying treatment is available. Therefore, a gene therapy approach aimed at restoring AP4S1 gene expression represents a rational therapeutic strategy for SPG52. This doctoral thesis presents the development of two models to assess the efficacy and safety of the proposed gene therapy approach employing an adeno-associated viral vector. Specifically, an in vivo model has been established, namely the first mouse model for SPG52 featuring a complete knockout of the AP4S1 gene (AP4S1 KO). Furthermore, an in vitro model has been constructed through the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from skin biopsies of a patient and two controls, with the purpose of producing iPSC-derived cortical neurons to create a human disease-relevant model. Following the successful generation and characterization of the iPSC-derived cortical neurons, patient-derived neurons demonstrated an accumulation of the primary cargo of the AP-4 complex, ATG9A, within the Trans-Golgi network. Additionally, abnormalities in neurite morphology and reduced neuronal network activity were observed. The overexpression of the AP4S1 gene successfully reestablished complex formation, thereby ameliorating the neuropathological phenotype. In parallel, the generation, establishment, and characterization of the AP4S1 KO mouse model were undertaken. As observed in 94% of SPG52 patients, this animal model effectively recapitulated the thinning of the CC. In addition to this phenotype, KO mice exhibited reductions in body weight, muscle strength, motor coordination, and lifespan in comparison to their wild-type (WT) littermates. Neuromuscular deficits identified in the hindlimb musculature of KO mice were substantiated by neuromuscular function assessments, which demonstrated decreased compound muscle action potential (CMAP). Furthermore, KO mice showed behavioral differences relative to WT mice, such as increased exploratory behavior without signs of anxiety, as observed in patients. To evaluate the efficacy of the proposed gene therapy approach, two cohorts of animals were administered an AAV9P31 adeno-associated viral vector carrying a correct copy of the human AP4S1 gene. One cohort received treatment during the neonatal stage, while the second cohort was treated during young adulthood. The phenotype rescue was assessed in both cohorts, demonstrating a complete restoration of CMAP and CC integrity, a partial rescue of CC thinning, motor coordination, and muscle strength; however, no effect was observed on the body weight of the animals. These promising results provide a foundation for safety trials, advancing the prospects for initiating clinical trials for SPG52 therapy. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, i la comunicació pública de l'obra, sempre que no sigui amb finalitats comercials, i sempre que es reconegui l'autoria de l'obra original. No es permet la creació d'obres derivades.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Col·lecció: |
Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
Paraparèsia espàstica 52 ;
Spastic paraplegia 52 ;
Paraparesia espástica 52 ;
Teràpia gènica ;
Gene therapy ;
Terapia génica ;
Malalties rares ;
Rare diseases ;
Enfermedades raras ;
Ciències de la Salut |
visitant ::
identificació
