| Fecha: |
2025 |
| Resumen: |
La llum és una eina versàtil que ofereix una font d'energia no invasiva i fàcilment modulable per controlar, de manera externa, processos biològics. Aquesta estratègia es basa en l'ús de substàncies moleculars fotoactives capaces d'interaccionar amb proteïnes o altres estructures endògenes per modificar-ne l'activitat sota irradiació. El control de l'activitat biològica es pot dur a terme amb alta resolució espacial i temporal, de manera no invasiva, selectiva i, sovint, reversible. Cosa que obre la porta a aplicacions de gran interès, com és el cas de l'estudi dels sistemes neuronals amb una precisió superior a la que permeten la farmacologia i l'electrofisiologia convencionals. Aquests objectius es poden assolir mitjançant dos grans grups de tècniques que es diferencien segons l'origen de les substàncies fotoactives utilitzades per al control dels processos biològics: l'optogenètica, basada fonamentalment en l'ús de proteïnes fotosensibles naturals (o modificades genèticament), i la fotofarmacologia, en què aquestes substàncies són molècules petites d'origen sintètic. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat explorar noves vies per millorar les prestacions de les tècniques optogenètiques i fotofarmacològiques actuals. Un dels principals avantatges d'aquestes tècniques és el seu confinament espacial, és a dir, la possibilitat d'induir processos selectivament a la zona irradiada. A la pràctica, però, aquesta resolució espacial es veu restringida per diversos factors, principalment per la dificultat de fotoexcitar selectivament un volum determinat dins d'una mostra biològica. D'una banda, la penetració de la llum es veu limitada per l'absorció i la dispersió causades per les biomolècules dels teixits, fet que dificulta l'accés al material biològic situat a més profunditat en experiments in vivo. De l'altra, quan s'utilitzen lents i objectius per focalitzar la llum, les dimensions del volum focal estan limitades per la difracció, i en el millor dels casos seran de centenars de nanòmetres tant en el pla focal com en l'eix axial de la mostra. Hi ha diverses estratègies que permeten superar algunes d'aquestes limitacions i millorar així la resolució espacial de la fotoexcitació. Tot i que es van desenvolupar originalment per augmentar la resolució en microscòpia òptica de fluorescència, actualment hi ha interès a aplicar-les en altres camps on el confinament de la llum és rellevant, com és el cas de l'optogenètica i la fotofarmacologia. Dues de les estratègies destacades per a aquest propòsit són l'absorció a dos fotons i l'excitació antagonista amb dos feixos de llum. Concretament, en aquesta tesi doctoral s'han estudiat tres casos on s'han aplicat aquestes estartègies: (1) El desenvolupament d'una eina fotofarmacològica basada en microscòpia RESOLFT per millorar la resolució espacial en el fotocontrol de receptors ionotròpics de glutamat; (2) El desenvolupament d'una estratègia per fotosensibilitzar el comportament de proteïnes optogenètiques sota excitació a dos fotons; i (3) El desenvolupament d'un nou lligand engabiat no destructiu estilbènic operatiu a dos fotons sota llum NIR per al control de receptors ionotròpics de glutamat. |
| Resumen: |
La luz es una herramienta versátil que ofrece una fuente de energía no invasiva y fácilmente modulable para controlar, de forma externa, procesos biológicos. Esta estrategia se basa en el uso de sustancias moleculares fotoactivas capaces de interactuar con proteínas u otras estructuras endógenas para modificar su actividad bajo irradiación. El control de la actividad biológica puede llevarse a cabo con alta resolución espacial y temporal, de manera no invasiva, selectiva y, a menudo, reversible. Esto abre la puerta a aplicaciones de gran interés, como el estudio de los sistemas neuronales con una precisión superior a la que permiten la farmacología y la electrofisiología convencionales. Estos objetivos pueden alcanzarse mediante dos grandes grupos de técnicas, que se diferencian según el origen de las sustancias fotoactivas utilizadas para el control de los procesos biológicos: la optogenética, basada fundamentalmente en el uso de proteínas fotosensibles naturales (o modificadas genéticamente), y la fotofarmacología, en la que estas sustancias son pequeñas moléculas de origen sintético. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido explorar nuevas vías para mejorar el rendimiento de las técnicas optogenéticas y fotofarmacológicas actuales. Una de las principales ventajas de estas técnicas es su confinamiento espacial, es decir, la posibilidad de inducir procesos selectivamente en la zona irradiada. En la práctica, sin embargo, esta resolución espacial se ve limitada por diversos factores, principalmente por la dificultad de fotoexcitar selectivamente un volumen determinado dentro de una muestra biológica. Por un lado, la penetración de la luz está limitada por la absorción y dispersión causadas por las biomoléculas presentes en los tejidos, lo que dificulta el acceso al material biológico situado a mayor profundidad en experimentos in vivo. Por otro lado, al utilizar lentes y objetivos para focalizar la luz, las dimensiones del volumen focal están limitadas por la difracción y, en el mejor de los casos, serán del orden de cientos de nanómetros tanto en el plano focal como en el eje axial de la muestra. Existen diversas estrategias que permiten superar algunas de estas limitaciones y, por tanto, mejorar la resolución espacial de la fotoexcitación. Aunque estas estrategias fueron desarrolladas originalmente para aumentar la resolución en microscopía óptica de fluorescencia, actualmente existe un gran interés en aplicarlas en otros campos donde el confinamiento de la luz es relevante, como en optogenética y fotofarmacología. Dos de las estrategias destacadas para este propósito son la absorción a dos fotones y la excitación antagónica con dos haces de luz. Concretamente, esta tesis doctoral ha estudiado tres casos en los que se han aplicado estas estrategias: (1) El desarrollo de una herramienta fotofarmacológica basada en microscopía RESOLFT para mejorar la resolución espacial en el fotocontrol de receptores ionotrópicos de glutamato; (2) El desarrollo de una estrategia para fotosensibilizar el comportamiento de proteínas optogenéticas bajo excitación a dos fotones; y (3) El desarrollo de un nuevo ligando enjaulado no destructivo de tipo estilbénico, operativo a dos fotones bajo luz NIR, para el control de receptores ionotrópicos de glutamato. |
| Resumen: |
Light is a versatile tool that provides a non-invasive and easily tunable energy source for externally controlling biological processes. This strategy relies on the use of photoactive molecular substances capable of interacting with proteins or other endogenous structures to modify their activity upon irradiation. The control of biological activity can be achieved with high spatial and temporal resolution, in a non-invasive, selective, and often reversible manner. This opens the door to applications of great interest, such as the study of neuronal systems with a precision beyond that of conventional pharmacology and electrophysiology. These objectives can be accomplished using two main groups of techniques, which differ according to the origin of the photoactive substances used to control biological processes: optogenetics, based mainly on the use of natural (or genetically modified) light-sensitive proteins, and photopharmacology, in which these substances are small synthetic molecules. The aim of this PhD has been to explore new approaches to improve the performance of current optogenetic and photopharmacological techniques. One of the main advantages of these techniques is their spatial confinement, that is, the ability to selectively induce processes in an irradiated area. In practice, however, this spatial resolution is limited by several factors, primarily the difficulty of selectively photoexciting a defined volume within a biological sample. On one hand, light penetration is constrained by absorption and scattering caused by biomolecules in the tissues, which hinders access to deeper biological material in in vivo experiments. On the other hand, when lenses and objectives are used to focus light, the focal volume is limited by diffraction and, at best, reaches dimensions of several hundred nanometers in both the focal plane and the axial direction of the sample. Various strategies have been developed to overcome some of these limitations and thereby enhance the spatial resolution of photoexcitation. Although they were initially designed to improve resolution in fluorescence optical microscopy, there is growing interest in applying these methods in other fields where precise light confinement is essential, such as optogenetics and photopharmacology. Two key strategies for this purpose are the two-photon absorption phenomenon and the antagonistic excitation with dual light beams. Specifically, this doctoral thesis explores three cases in which these strategies have been applied: (1) The development of a photopharmacological tool based on RESOLFT microscopy to improve spatial resolution in the photocontrol of ionotropic glutamate receptors; (2) The development of a strategy to photosensitize the behavior of optogenetic proteins under two-photon excitation; and (3) The development of a new non-destructive caged stilbene-based ligand, operative under two-photon absorption using NIR light, for controlling ionotropic glutamate receptors. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Química |
| Derechos: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Lengua: |
Català |
| Colección: |
Programa de Doctorat en Química |
| Documento: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Materia: |
Fotofarmacologia ;
Photopharmacology ;
Fotofarmacología ;
Optogenètica ;
Optogenetics ;
Optogenética ;
Dos fotons ;
Two-photon ;
Dos fotones ;
Ciències Experimentals |
visitante ::
identificación
dir.
