| Data: |
2026 |
| Resum: |
Les molècules del Complex Principal d'Histocompatibilitat (MHC) son proteïnes de membrana encarregades de presentar pèptids derivats de proteïnes pròpies o estranyes als limfòcits T, activant així una resposta immunitària específica. Existeixen dos tipus principals: MHC de classe I i de classe II. Les molècules de MHC-I (en humans, HLA-A, HLA-B y HLA-C) presenten pèptids endògens, provinents de proteïnes intracel·lulars, mentre que les de MHC-II (HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ) presenten pèptids exògens, de proteïnes internalitzades o de membrana. Els gens del MHC son els més polimòrfics del genoma humà. Aquest polimorfisme es concentra a les regions que formen el solc d'unió a pèptids, on les cadenes laterals dels aminoàcids del lligand interactuen amb cavitats o pockets específics. La combinació d'aquestes cavitats defineix la especificitat de cada al·lel i el seu repertori de pèptids presentats. En les molècules de MHC-II, tant les cadenes α com β contribueixen al polimorfisme, tot i que en el cas de HLA-DR la variabilitat es concentra principalment en la cadena β, ja que la α és poc polimòrfica i no modifica la interacció amb els pèptids. El virus SARS-CoV-2, agent causant de la COVID-19, és un coronavirus zoonòtic de ARN monocatenari positiu i amb envolta. El seu genoma codifica quatre proteïnes estructurals: Spike (S), Envelope (E), Membrane (M) i Nucleocapsid (N). La proteïna S, responsable de la unió al receptor (ACE2) i la fusió de membranes, és la més immunogènica i la que més mutacions acumula, el que ha resultat en variants, com Òmicron (llinatge B. 1. 2. 529). La infecció produeix símptomes comuns com febre, tos i dispnea, tot i que pot resultar greu en persones grans o amb comorbiditats. Les molècules de MHC exerceixen un paper essencial en la resposta immunitària en front del SARS-CoV-2, i els pèptids que presenten van ser clau en el disseny de vacunes. La seva identificació requereix la purificació dels complexos MHC-pèptid, l'aïllament de l'immunopeptidoma i l'anàlisi per espectrometria de masses, tècnica que ha permès descobrir centenars de milers de lligands. La cisteïna, un aminoàcid amb un grup tiol altament reactiu, pot patir modificacions postraduccionals (oxidacions, formació de ponts disulfur, etc. ). Tot i això, els estudis de l'immunopeptidoma han mostrat una quantitat de pèptids amb cisteïna menor de l'esperada, la qual cosa suggereix una subestimació d'aquests en les anàlisis convencionals. Així, l'objectiu principal de la tesi va ser optimitzar la detecció de pèptids amb cisteïna en els immunopeptidomes associats a les molècules HLA-DR mitjançant un protocol de reducció i alquilació que estabilitza aquest aminoàcid. Es van utilitzar tres línies cel·lulars d'origen limfoide (BEN, C1R y Raji), observant un enriquiment en pèptids amb cisteïna sense afectar a la qualitat de les mostres. A més, es van clonar i expressar en cèl·lules C1R la majories dels al·lotips més freqüents d'HLA-DRB1, juntament amb con HLA-DRB3*02:02 i HLA-DRB4*01:03, per generar línies estables. A partir d'aquestes, es van purificar els immunopeptidomes tractats amb el nou protocol, el que va permetre incrementar el número de pèptids amb cisteïna detectats i analitzar la seva contribució als motius d'ancoratge característics de cada al·lotip de HLA-DR. Finalment, la metodologia es va aplicar a cèl·lules HEK293 transfectades amb el gen de la proteïna Spike de la variant Òmicron de SARS-CoV-2. Aquesta estratègia va permetre identificar pèptids derivats d'aquesta proteïna no descrits prèviament, tant en molècules d'HLA-I com d'HLA-II (després de la transfecció del gen de CIITA). En conjunt, els resultats demostres que la reducció i alquilació d ela cisteïna millora la detecció i caracterització de pèptids que contenen aquest residu, aportar una eina valuosa per a l'estudi de l'immunopeptidoma i la comprensió de la resposta immunitària front a patògens, com SARS-CoV-2. |
| Resum: |
Las moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) son proteínas de membrana encargadas de presentar péptidos derivados de proteínas propias o extrañas a los linfocitos T, activando así una respuesta inmunitaria específica. Existen dos tipos principales: MHC de clase I y de clase II. Las moléculas de MHC-I (en humanos, HLA-A, HLA-B y HLA-C) presentan péptidos endógenos, provenientes de proteínas intracelulares, mientras que las de MHC-II (HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ) presentan péptidos exógenos, de proteínas internalizadas o de membrana. Los genes del MHC son los más polimórficos del genoma humano. Este polimorfismo se concentra en las regiones que forman el surco de unión al péptido, donde las cadenas laterales de los aminoácidos del ligando interactúan con cavidades o pockets específicos. La combinación de estas cavidades define la especificidad de cada alelo y su repertorio de péptidos presentados. En las moléculas de MHC-II, tanto las cadenas α como β contribuyen al polimorfismo, aunque en el caso de HLA-DR la variabilidad se concentra principalmente en la cadena β, dado que la α es poco polimórfica y no modifica la interacción con los péptidos. El virus SARS-CoV-2, agente causante de la COVID-19, es un coronavirus zoonótico de ARN monocatenario positivo y con envoltura. Su genoma codifica cuatro proteínas estructurales: Spike (S), Envelope (E), Membrane (M) y Nucleocapsid (N). La proteína S, responsable de la unión al receptor (ACE2) y la fusión de membranas, es la más inmunogénica y la que más mutaciones acumula, lo que ha dado lugar a variantes, como Ómicron (linaje B. 1. 1. 529). La infección produce síntomas comunes como fiebre, tos y disnea, aunque puede resultar grave en personas mayores o con comorbilidades. Las moléculas de MHC desempeñan un papel esencial en la respuesta inmunitaria frente a SARS-CoV-2, y los péptidos que presentan fueron clave en el diseño de vacunas. Su identificación requiere la purificación de los complejos MHC-péptido, el aislamiento del inmunopeptidoma y su análisis por espectrometría de masas, técnica que ha permitido descubrir cientos de miles de ligandos. La cisteína, un aminoácido con un grupo tiol altamente reactivo, puede sufrir modificaciones postraduccionales (oxidaciones, formación de puentes disulfuro, etc. ). Sin embargo, los estudios del inmunopeptidoma han mostrado una cantidad de péptidos con cisteína menor de la esperada, lo que sugiere una subestimación de estos en los análisis convencionales. Así, el objetivo principal de la tesis fue optimizar la detección de péptidos con cisteína en los inmunopeptidomas asociados a las moléculas HLA-DR mediante un protocolo de reducción y alquilación que estabiliza este aminoácido. Se utilizaron tres líneas celulares de origen linfoide (BEN, C1R y Raji), observándose un enriquecimiento en péptidos con cisteína sin afectar la calidad de las muestras. Además, se clonaron y expresaron en células C1R la mayoría de los alotipos más frecuentes de HLA-DRB1, junto con HLA-DRB3*02:02 y HLA-DRB4*01:03, para generar líneas estables. A partir de éstas, se purificaron los inmunopeptidomas tratados con el nuevo protocolo, lo que permitió incrementar el número de péptidos con cisteína detectados y analizar su contribución a los motivos de anclaje característicos de cada alotipo de HLA-DR. Finalmente, la metodología se aplicó a células HEK293 transfectadas con el gen de la proteína Spike de la variante Ómicron de SARS-CoV-2. Esta estrategia permitió identificar péptidos derivados de dicha proteína no descritos previamente, tanto en moléculas HLA-I como HLA-II (tras la transfección del gen de CIITA). En conjunto, los resultados demuestran que la reducción y alquilación de la cisteína mejora la detección y caracterización de péptidos que contienen este residuo, aportando una herramienta valiosa para el estudio del inmunopeptidoma y la comprensión de la respuesta inmunitaria frente a patógenos, como SARS-CoV-2. |
| Resum: |
Major Histocompatibility Complex (MHC) molecules are membrane proteins responsible for presenting peptides derived from self or foreign proteins to T lymphocytes, thereby activating a specific immune response. There are two main types: MHC class I and class II. MHC-I molecules (in humans, HLA-A, HLA-B, and HLA-C) present endogenous peptides originating from intracellular proteins, whereas MHC-II molecules (HLA-DR, HLA-DP, and HLA-DQ) present exogenous peptides derived from internalized or membrane proteins. The MHC genes are the most polymorphic in the human genome. This polymorphism is concentrated in the regions that form the peptide-binding groove, where the side chains of the ligand's amino acids interact with specific cavities or pockets. The combination of these pockets defines the specificity of each allele and its repertoire of presented peptides. In class II MHC molecules, both the α and β chains contribute to polymorphism, although in HLA-DR the variability is mainly concentrated in the β chain, since the α chain is poorly polymorphic and does not affect peptide interaction. SARS-CoV-2 virus, the causative agent of COVID-19, is an enveloped, positive-sense single-stranded RNA zoonotic coronavirus. Its genome encodes four structural proteins: Spike (S), Envelope (E), Membrane (M), and Nucleocapsid (N). The S protein, responsible for receptor (ACE2) binding and membrane fusion, is the most immunogenic and the one that accumulates the most mutations, leading to variants such as Omicron (lineage B. 1. 1. 529). Infection produces common symptoms such as fever, cough, and dyspnea, but it can become severe in elderly individuals or those with comorbidities. MHC molecules play an essential role in the immune response against SARS-CoV-2, and the peptides they present were key to vaccine design. Their identification requires purification of MHC-peptide complexes, isolation of the immunopeptidome, and analysis by mass spectrometry, a technique that has enabled the discovery of hundreds of thousands of ligands. Cysteine, an amino acid with a highly reactive thiol group, can undergo post-translational modifications (oxidation, disulfide bond formation, etc. ). However, immunopeptidome studies have revealed a lower-than-expected number of cysteine-containing peptides, suggesting that their presence has been underestimated in conventional analyses. Thus, the main objective of this thesis was to optimize the detection of cysteine-containing peptides in HLA-DR-associated immunopeptidomes through a reduction and alkylation protocol that stabilizes this amino acid. Three lymphoid-derived cell lines (BEN, C1R, and Raji) were used, resulting in an enrichment of cysteine-containing peptides without affecting sample quality. In addition, most of the common HLA-DRB1 allotypes, along with HLA-DRB3*02:02 and HLA-DRB4*01:03, were cloned and expressed in C1R cells to generate stable lines. From these, immunopeptidomes treated with the new protocol were purified, which increased the number of detected cysteine-containing peptides and allowed the analysis of their contribution to the anchor motifs characteristic of each HLA-DR allotype. Finally, the methodology was applied to HEK293 cells transfected with the gene encoding the Spike protein from the Omicron variant of SARS-CoV-2. This approach enabled the identification of previously undescribed peptides derived from this viral protein, in both HLA-I and HLA-II molecules (after transfection with the CIITA gene). Overall, the results demonstrate that cysteine reduction and alkylation improve the detection and characterization of peptides containing this residue, providing a valuable tool for immunopeptidome research and for understanding the immune response against pathogens, such as SARS-CoV-2. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Immunologia Avançada |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Castellà |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
SARS-CoV-2 ;
HLA ;
Cisteïna ;
Cysteine ;
Cisteína ;
Ciències de la Salut |
visitant ::
identificació
dir.
