| Date: |
2026 |
| Abstract: |
Per al mitocondri resulta essencial mantenir un contingut de dNTPs, en quantitat i proporció, adequades per tal de garantir el correcte manteniment de l'ADN mitocondrial (ADNmt). Tradicionalment, s'ha considerat que totes les espècies de dNTPs s'han de trobar en proporcions similars i en forma soluble a la matriu mitocondrial, on es trobarien disponibles per als enzims que participen en els processos de replicació i reparació de l'ADNmt. No obstant, en estudis previs del nostre grup es va observar que, tant en cèl·lules humanes com en diferents teixit de ratolí, el dGTP mitocondrial es troba significativament sobrerepresentat davant dels altres dNTPs, i de forma molt majoritària es troba associat a NDUFA10. La NDUFA10 és una subunitat accessòria del complex I (CI) de la cadena respiratòria mitocondrial per a la qual encara no s'ha descrit cap funció específica dins del mateix, a banda del seu paper essencial en l'assemblatge de l'holoenzim. No obstant, comparteix un domini altament conservat amb les desoxiribonucleòsid quinases (dNK) implicades en la síntesis de dNTPs a través de la ruta de salvament. Amb la intenció d'estudiar el paper biològic de la interacció NDUFA10-dGTP es va realitzar un primer estudi en cèl·lules humanes on es varen introduir mutacions al lloc d'unió del nucleòtid en el domini dNK de la NDUFA10 humana (E160A; R161A). Aquests estudis van evidenciar una disminució en l'afinitat de la NDUFA10 mutada pel nucleòtid, el que es traduïa en una reducció del 50% en el contingut de dGTP mitocondrial, mentre la proteïna NDUFA10, així com el CI, es mantenien estables. El contingut en dNTPs està marcadament influenciat pel moment del cicle cel·lular, essent molt elevat en cèl·lules proliferatives per tal de nodrir la replicació del genoma nuclear, i reduint-se dràsticament en teixits quiescents. Per investigar el paper biològic de la interacció NDUFA10-dGTP in vivo, i donada l'elevada homologia entre la proteïna humana i murina, es va generar un model animal que expressés de forma constitutiva les mateixes mutacions que havíem estudiat en cèl·lules humanes (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A o Ndufa10KI/KI). En el decurs d'aquesta tesi hem observat com els animals Ndufa10KI/KI desenvolupen una cardiomiopatia hipertròfica que causa la seva mort prematura al voltant dels set mesos d'edat. Aquest fenotip està probablement relacionat amb el fet que les mutacions introduïdes a la proteïna NDUFA10 de ratolí provoquen la inestabilitat de la mateixa i interfereixen amb l'assemblatge, supraorganització i activitat del CI. Aquesta afectació és heterogènia entre els teixits estudiats, provocant una alteració greu de la funció oxidativa especialment al cor, el que probablement es relaciona amb la pèrdua de contractilitat del múscul cardíac. Per aquest motiu, considerem que aquest animal esdevindrà un bon model de malaltia mitocondrial per estudiar la cardiomiopatia deguda al dèficit aïllat en CI. D'altra banda, la introducció de les mutacions E160A i R161A a NDUFA10 comporta un descens en el contingut de dGTP a tots els teixits investigats. No obstant, aquesta reducció es limita a la fracció de nucleòtid mitocondrial unida a proteïna, i la concentració de dGTP lliure a la matriu es manté inalterada. En concordança, no s'observen alteracions a l'ADNmt. Tot i que en condicions basals trobem la major part del dGTP mitocondrial unit a la NDUFA10 wild-type, davant un increment sobtat de la concentració de nucleòtid, observem com la proteïna no es troba saturada i és capaç d'absorbir una part rellevant del dGTP, limitant l'expansió del pool de nucleòtid lliure. Això demostra que in vivo, la interacció NDUFA10-dGTP és dinàmica i ens permet proposar-la com a un nou mecanisme molecular que actuï regulant la disponibilitat del nucleòtid a la matriu mitocondrial. |
| Abstract: |
Para la mitocondria resulta esencial mantener un contenido de dNTPs, en cantidad y proporción, adecuadas para garantizar el correcto mantenimiento del ADN mitocondrial (ADNmt). Tradicionalmente, se ha considerado que todas las especies de dNTPs deben encontrarse en proporciones similares y en forma soluble en la matriz mitocondrial, donde se encontrarían disponibles para las enzimas que participan en los procesos de replicación y reparación del ADNmt. Sin embargo, en estudios previos de nuestro grupo se observó que, tanto en células humanas como en distintos tejidos de ratón, el dGTP mitocondrial se encuentra significativamente sobrerrepresentado frente a los otros dNTPs, y de forma muy mayoritaria se encuentra asociado a NDUFA10. La NDUFA10 es una subunidad accesoria del complejo I (CI) de la cadena respiratoria mitocondrial para la que todavía no se ha descrito ninguna función específica dentro del mismo, aparte de su papel esencial en el ensamblaje de la holoenzima. Sin embargo, comparte un dominio altamente conservado con las desoxirribonucleósido quinasas (dNK) implicadas en la síntesis de dNTPs a través de la ruta de salvamento. Con la intención de estudiar el papel biológico de la interacción NDUFA10-dGTP se realizó un primer estudio en células humanas donde se introdujeron mutaciones en el lugar de unión del nucleótido en el dominio dNK de la NDUFA10 humana (E160A; R161A). Estos estudios evidenciaron una disminución en la afinidad de la NDUFA10 mutada por el nucleótido, lo que se traducía en una reducción del 50% en el contenido de dGTP mitocondrial, mientras que la proteína NDUFA10, así como el CI, se mantenían estables. El contenido en dNTPs está marcadamente influenciado por el momento del ciclo celular, siendo muy elevado en células proliferativas para nutrir la replicación del genoma nuclear, y reduciéndose drásticamente en tejidos quiescentes. Para investigar el papel biológico de la interacción NDUFA10-dGTP in vivo, y dada la elevada homología entre la proteína humana y murina, se generó un modelo animal que expresara de forma constitutiva las mismas mutaciones que habíamos estudiado en células humanas (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A o Ndufa10KI/KI). En el transcurso de esta tesis hemos observado cómo los animales Ndufa10KI/KI desarrollan una cardiomiopatía hipertrófica que causa su muerte prematura en torno a los siete meses de edad. Este fenotipo está probablemente relacionado con el hecho de que las mutaciones introducidas en la proteína NDUFA10 de ratón provocan la inestabilidad de la misma e interfieren con el ensamblaje, supraorganización y actividad del CI. Esta afectación es heterogénea entre los tejidos estudiados, provocando una alteración grave de la función oxidativa especialmente en el corazón, lo que probablemente se relaciona con la pérdida de contractilidad del músculo cardíaco. Por este motivo, consideramos que este animal será un buen modelo de enfermedad mitocondrial para estudiar la cardiomiopatía debida al déficit aislado en CI. Por otra parte, la introducción de las mutaciones E160A y R161A en NDUFA10 comporta un descenso en el contenido de dGTP en todos los tejidos investigados. Sin embargo, esta reducción se limita a la fracción de nucleótido mitocondrial unida a proteína, y la concentración de dGTP libre en la matriz se mantiene inalterada. En concordancia, no se observan alteraciones en el ADNmt. Aunque en condiciones basales encontramos la mayor parte del dGTP mitocondrial unido a la NDUFA10 wild-type, ante un incremento repentino de la concentración de nucleótido, observamos cómo la proteína no se encuentra saturada y es capaz de absorber una parte relevante del dGTP, limitando la expansión del pool de nudo. Esto demuestra que in vivo, la interacción NDUFA10-dGTP es dinámica y nos permite proponerla como un nuevo mecanismo molecular que actúe regulando la disponibilidad del nucleótido en la matriz mitocondrial. |
| Abstract: |
Mitochondria need to keep a pool of dNTPs in the adequate quantity and proportion to guarantee the correct maintenance of mitochondrial DNA (mtDNA). Traditionally, it has been considered that all species of dNTPs must be found in similar proportions and in soluble form in the mitochondrial matrix, where they would be available to the enzymes that participate in the replication and repair processes of mtDNA. However, in previous studies by our group it was observed that, both in human cells and in different mouse tissues, mitochondrial dGTP is significantly overrepresented compared to other dNTPs, and is mostly associated with NDUFA10. NDUFA10 is an accessory subunit of complex I (CI) of the mitochondrial respiratory chain with no known specific function, other than its essential role in the assembly of the holoenzyme. However, it shares a highly conserved domain with deoxyribonucleoside kinases (dNK) involved in the synthesis of dNTPs via the salvage pathway. To study the biological role of the NDUFA10-dGTP interaction, an initial study was conducted in human cells where mutations were introduced at the nucleotide-binding site in the dNK domain of human NDUFA10 (E160A; R161A). These studies showed a decrease in the affinity of the mutated NDUFA10 for the nucleotide, resulting in a 50% reduction in the mitochondrial dGTP content, while the NDUFA10 protein, and the CI, remained stable. The dNTP pool size is markedly influenced by the cell cycle, being very high in proliferating cells to fuel nuclear genome replication, while it is drastically reduced in quiescent tissues. To investigate the biological role of the NDUFA10-dGTP interaction in vivo, and given the high identity between the human and murine protein, an animal model was generated that constitutively expressed the same mutations that we had previously studied in human cells (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A or Ndufa10KI/KI). During this thesis we have observed how Ndufa10KI/KI animals develop a hypertrophic cardiomyopathy leading to premature death around seven months of age. This phenotype is likely related to the fact that mutations introduced into the mouse NDUFA10 protein cause its instability and interfere with the assembly, supraorganization and activity of the CI. This effect is heterogeneous among the tissues studied, causing a severe oxidative dysfunction especially in the heart, which is probably related to the loss of cardiac muscle contractility. For this reason, we think this animal will become a good mitochondrial disease model for studying cardiomyopathy due to isolated CI deficiency. On the other hand, the introduction of the E160A and R161A mutations into NDUFA10 causes a decrease in dGTP content in all the tissues investigated. However, this reduction is limited to the fraction of mitochondrial nucleotide bound to the protein, while the concentration of free dGTP in the matrix remains unchanged. Accordingly, no alterations are observed in mtDNA. Although under basal conditions we find most mitochondrial dGTP is bound to wild-type NDUFA10, in response to a sudden increase in nucleotide concentration, the protein proves not to be saturated and is able to absorb a significant part of the dGTP increase, thus limiting the expansion of the free nucleotide pool. This demonstrates that in vivo, the NDUFA10-dGTP interaction is dynamic and allows us to propose it as a novel molecular mechanism regulating dGTP availability in the mitochondrial matrix. |
| Note: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Rights: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Language: |
Català |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Subject: |
Complex I ;
Complejo I ;
DNTPs ;
NDUFA10 ;
Ciències Experimentals |
guest ::
dir.
