Per citar aquest document: http://ddd.uab.cat/record/131509
Aproximacions genètiques per l'estudi de les funcions de la proteïna fosfatasa Ptc1 en S. cerevisiae
Tatjer Recordà, Laura
Ariño Carmona, Joaquín, dir.
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2015
Descripció: 1 recurs electrònic (224 p.)
Resum: Les proteïnes fosfatases de tipus 2C (PP2C) conformen una família d'enzims monomèrics conservats al llarg de l'evolució. En Saccharomyces cerevisiae hi ha 7 gens estructuralment relacionats que codifiquen set isoformes de les PP2C (PTC1-7). La isoforma més estudiada en llevats és Ptc1 ja que aquesta fosfatasa pot dur a terme múltiples funcions específiques que no comparteix amb les altres PP2C. Com a resultat, el mutant ptc1 presenta defectes de creixement enfront diverses formes d'estrès com els que activen la via de senyalització de la integritat de la paret cel·lular (ex. pH alcalí, blanc de calcoflúor i cafeïna), en presència de cations (LiCl, CaCl2, ZnCl2. . . ), enfront rapamicina (un inhibidor de la via TOR que senyalitza la manca de nutrients) o en presència d'etanol com a única font de carboni. A més, presenta problemes en l'herència de diferents orgànuls com són els mitocondris, el reticle endoplasmàtic o les vacuoles, entre molts altres defectes. Malgrat totes aquestes alteracions només es coneixen dos substrats de Ptc1: la quinasa Hog1 implicada en la via d'estrès osmòtic, i Ste5, una proteïna adaptadora de la MAPK que respon a les feromones. L'objectiu d'aquest treball consisteix en identificar possibles dianes d'acció de Ptc1 que permetin entendre millor els mecanismes funcionals d'aquesta fosfatasa. Degut a dificultats metodològiques inherents al treball amb fosfatases, vam dissenyar dues aproximacions genètiques que ens permetessin assolir el nostre objectiu. La primera estratègia consistia en rastrejar biblioteques genòmiques de llevat per trobar gens que sobreexpressats alleugerin la sensibilitat a pH alcalí, blanc de calcoflúor i rapamicina d'una soca ptc1Δ. Com a resultat de la cerca s'han identificat un total de 25 gens que alleugeren un o varis fenotips característics d'un mutant ptc1. La majoria dels gens s'han classificat en tres grups funcionals: cicle cel·lular, funció vacuolar i tràfic de proteïnes, i manteniment de la integritat de la paret cel·lular. En aquest treball es presenta un model que apunta que la hiperactivació del mòdul MAPK de la via Slt2 influiria en l'activitat de Cdc28 la qual seria limitant en un mutant Ptc1. D'aquesta forma es relaciona per primera vegada Ptc1 amb el cicle cel·lular. Degut que PPH21 i PPH22 (que codifiquen dues subunitats catalítiques redundants de la proteïna fosfatasa de tipus 2A) són els supressors que han presentat major potència de recuperació fenotípica en un mutant ptc1, hem aprofundit l'estudi de la interacció entre Ptc1 i aquests dos supressors. Els resultats obtinguts indiquen que la pèrdua de Ptc1 alteraria els diferents complexes de les PP2A que actuen com efectors de la via TOR quan aquesta es troba inhibida. La segona aproximació genètica es va basar en la hipòtesis que els defectes observats en un mutant ptc1 probablement es deuen a un estat hiperfosforilat d'un o més possibles substrats de Ptc1. Per això, vam generar una col·lecció de 115 mutants on es van combinar la supressió dels gens no essencials que codifiquen proteïnes quinases o subunitats reguladores d'alguna d'elles amb la mutació ptc1 i es va analitzar el seu creixement en vuit condicions on el mutant ptc1 és sensible. A partir de la integració dels resultats s'han detectat una àmplia varietat d'interaccions genètiques entre Ptc1 i diferents quinases, en consonància amb una àmplia extensió funcional de Ptc1. Tot i així, només la mutació de Mkk1 (una de les dues MAPKK de la via de la integritat de la paret cel·lular) és capaç de suprimir o alleugerir tots els defectes fenotípics estudiats de la soca ptc1Δ. Les dades obtingudes mostren que part dels defectes de ptc1 estan relacionats amb la hiperactivació de la quinasa Slt2 que actua downstream de Mkk1, reforcen la idea que Mkk1 és la principal MAPKK que actua sobre Slt2 i permeten postular que Mkk1 podria ser una diana important de Ptc1.
Resum: Type 2C protein phosphatases (PP2Cs) form a family of monomeric enzymes conserved throughout evolution. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, there are seven structurally related genes that encode different isoforms of PP2Cs (PTC1-7). Ptc1 is the most studied PP2C isoform in yeast because this phosphatase can perform multiple specific functions not shared by the other PP2Cs. As a result, a ptc1 mutant fails to grow against various forms of stress such as those that activate the cell wall signaling pathway (eg. alkaline pH , Calcofluor white and caffeine), in the presence of cations (LiCl, CaCl2, ZnCl2, …), rapamycin (an inhibitor of the TOR pathway that mediates the lack of nutrients response) or in plates with ethanol as the sole carbon source. A ptc1 mutant also presents defects in organelle inheritance such as mitochondria, endoplasmic reticulum or vacuoles, among many other defects. Despite all of these alterations only two substrates of this isoform are known: the Hog1 kinase involved in osmoregulation, and the pheromone-responsive MAPK scaffold protein Ste5. The aim of this study is to identify possible functional mechanisms of Ptc1. Due to methodological difficulties inherent in working with phosphatases, we designed two genetic approaches to achieve our goal. The first strategy was based on the screen of yeast genomic library to find genes that, when overexpressed in a ptc1 mutant, abolish or alleviate the sensitivity of this strain to alkaline pH, Calcofluor white or rapamycin. As a result we identified a total of 25 genes that alleviate one or several characteristic phenotypes of the ptc1 mutant. Most of these genes were classified into three functional groups: cell cycle regulation, vacuolar function and protein sorting, and cell wall integrity. We present a model where the hyperactivation of the Slt2 MAPK module would decrease the activity of Cdc28, which could become limiting in a ptc1 mutant. This would represent the first evidence of a possible role of Ptc1 on cell cycle regulation. We have focused on the relationship between Ptc1 and the two suppressors that exhibited the strongest ability to recover different phenotypes: PPH21 and PPH22, which encode two redundant catalytic subunits of protein phosphatase type 2A. The results indicate that loss of Ptc1 alters different PP2A complexes that act as effectors of the TOR pathway when it is inhibited. The second genetic approach was based on the hypothesis that the ptc1 mutant defects are probably due to an hyperphosphorilated state of one or more Ptc1 substrates. Therefore, we generate a collection of 115 mutants in which we combined the deletion of nonessential genes encoding catalytic subunits of protein kinases or their regulatory proteins with the ptc1 mutation, and analyzed their growth in eight different conditions in which the ptc1 mutant is sensitive. Integration of the results allowed detecting a wide variety of genetic interactions between Ptc1 and different kinases, in agreement with the wide functional spread of the Ptc1 phosphatase. However, only the Mkk1 mutation (one of the two MAPKK of the cell wall integrity pathway) can lighten or eliminate all phenotypic defects studied in the ptc1Δ strain. The data obtained show that at least part of ptc1 defects are related to the hyperactivation of the Slt2 kinase downstream Mkk1, reinforces the idea that Mkk1 is the main MAPKK acting on Slt2 signaling, and points to Mkk1 as a likely target for the Ptc1 phosphatse.
Nota: Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2015
Drets: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Llengua: Català.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
ISBN: 9788449051999

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/287896


224 p, 4.0 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2015-04-13, darrera modificació el 2016-06-04



   Favorit i Compartir