| Resumen: |
L'anàlisi sistemàtic de la fisiologia cel·lular és de gran importància en la millora del coneixement sobre els microorganismes. En aquesta direcció, la biologia de sistemes ens permet l'anàlisi quantitatiu de diferents nivells fisiològics obtenint representacions in silico de les vies metabòliques estudiades que, en conjunt, s'adrecen a la millor comprensió del comportament de sistemes biològics complexos. Aquest projecte de recerca va ser dissenyat per contribuir en la comprensió de la fisiologia de Pichia pastoris sota diferents condicions d'estrès. Específicament, aquesta tesis se centre en l'estudi sistemàtic del conjunt de metabòlits lliures dins la cèl·lula i en la velocitat que aquests es transformen. En el Capítol 2, una caracterització dels principals component de la biomassa de P. pastoris es va realitzadar sota diferents condicions de. Per una altre part, la consistència dels fluxos dels metabòlits extracel·lulars van ser utilitzats per identificar la producció d'un subproducte de fermentació, arabinitol. En el Capítol 3, s'obtingué la relació entre diferents fluxos metabòlics del metabolisme central del carboni de P. pastoris mitjançant l'estudi del carboni marcat dels aminoàcids sintetitzats de novo. Posteriorment, aquest valors van ser utilitzats delimitant l'anàlisi de fluxos metabòlics sota diferents condicions d'oxigenació i producció de proteïna recombinant. Els resultat més destacats obtinguts foren la gran similitud entre els fluxos estimats per les soques productora i control en condicions equivalents. Tot i així, diferencies clares van ser observades quan es van comparar el patró de fluxos corresponents a diferents nivells d'oxigenació. L'anàlisi dels metabòlits lliures dins la cèl·lula va començar en el Capítol 4 amb l'avaluació sistemàtica de cinc protocols de parada ràpida del metabolisme en P. pastoris respecte la concentració de metanol i la temperatura. Com a resultat, la parada del metabolisme realitzada a -27ºC amb una solució de 60% v/v de metanol a ser amb la que menys pèrdues es van observar. Consecutivament, es va demostrar que cinc temps de residència són els necessaris per arribar a un estat estacionari del metabòlits intracel·lulars en cultius amb glucosa limitant. D'altra banda, sota les mateixes condicions de treball, els perfils intracel·lulars dels principals metabòlits eren similars entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. En el Capítol 5, l'estequiometria redox i energètica de P. pastoris va ser validada veient un augment en els requeriments energètics d'aquesta sota condicions deficitàries d'oxigen. A més a més, es va realitzar un anàlisi termodinàmic dels metabòlits intracel·lulars mitjançant lo qual s'obtingueren millores en el patró de fluxos en la via de les pentoses fosfat conjuntament amb informació de l'estat redox del citosol. En el Capítol 6, la regulació transcripcional i termodinàmica dels fluxes del metabolisme central del carboni va ser investigada entre diferents condicions de cultiu. En general, la contribució dels diferents nivells omics en el canvi final dels fluxos metabòlics van resultar ser diferents entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. Específicament, per P. pastoris, la regulació transcripcional va ser significant en la majoria de reaccions, contràriament al que s'havia descrit per S. cerevisiae. Finalment, en el Capítol 7, per una millor comprensió de l'efecte i la interacció de la disponibilitat d'oxigen i la producció d'una proteïna forania, es va realitzar un anàlisi quantitatiu del aminoàcids lliures intracel·lulars sota la producció d'aquesta proteïna i en diferents condicions d'oxigenació. Els valors obtinguts indicaren una variació significativa d'aquests aminoàcids intracel·lulars entre diferents disponibilitats d'oxigen. Sorprenentment, l'expressió d'aquesta es va veure que tenia un impacte limitat, però significant, en els pools d'aminoàcids. Amb tot, els canvis individuals observats no presentaven una correlació amb l'abundància relativa d'aquests en la proteïna recombinant, en canvi, concordava amb la variació de la composició aminoacídica de la biomassa. 90%) were obtained for all quenching procedures tested. However, quenching at -27ºC in 60% v/v methanol performed slightly better in terms of leakage minimization. Thereafter, it was demonstrated that five residence times under glucose limitation were enough to reach stable intracellular metabolite pools. Moreover, when comparing P. pastoris and S. cerevisiae metabolomes, under the same cultivation conditions, similar metabolite fingerprints were found in both yeasts, except for the lower glycolysis. In Chapter 5, the redox and energy stoichiometry of P. pastoris was validated showing increasing energy requirements as the oxygen availability became shortage. In addition, a network-embedded thermodynamic analysis of the quantitative intracellular metabolites pools was performed allowing an improvement of the non-oxidative pentose phosphate pathway fluxes as well as determination of the oxygen impact over the redox state of the cytosol. In Chapter 6, the transcriptional and thermodynamic regulations over the metabolic flow between conditions were investigated for the central carbon metabolism reactions. Overall, the different omic contributions to the final metabolic flux changes were resulted to be different between P. pastoris and S. cerevisae. Specifically, for P. pastoris, transcriptional regulation was found to be in most cases significant, contrarily to the baker yeast. Finally, in Chapter 7, to better understand the effect and interplay of oxygen availability and foreign protein secretion on central metabolism, a first quantitative metabolomic analysis of free amino acids pools in a recombinant P. pastoris strain growing under different oxygen availability conditions was performed. The values obtained indicated significant variations in the intracellular amino acid levels due to different oxygen availability conditions. Notably, even that foreign protein productivities were relatively low, recombinant protein production was found to have a limited but significant impact. However, observed changes in individual amino acids pools were not correlated with their corresponding relative abundance in the recombinant protein sequence, but to the overall cell protein amino acid compositional variations. |
visitante ::
identificación
