Per citar aquest document: https://ddd.uab.cat/record/185725
Anaerobic microbial transformation of chlorinated alkanes in cultures derived from Besòs River estuary sediments / Siti Hatijah Mortan ; supervised by Dr. Ernest Marco Urrea, Dra. Gloria Caminal Saperas
Mortan, Siti Hatijah, autor
Marco Urrea, Ernest, supervisor acadèmic
Caminal i Saperas, Glòria, supervisor acadèmic
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental

Publicació: [Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2017
Descripció: 1 recurs en línia (219 pàgines)
Resum: Els compostos orgànics halogenats (organohalogenats) són recalcitrants i presenten efectes tòxics per la salut humana i l'ecosistema. A partir d'uns sediments de la desembocadura del riu Besòs (Barcelona, Espanya) es va establir un cultiu anaerobi estable i no metanogènic que exclusivament dehalogenava cloro- i bromoalcans que tenen els àtoms d'halògens en carbonis adjacents via dihaloeliminació. L'aplicació de cebadors específics derivats a partir del gen 16rRNA de diferents bacteris dehalorespiradors junt amb les observacions fisiològiques del cultiu declorador indicaren que una soca de Dehalogenimonas era la responsable de la degradació dels alcans clorats. L'augment de còpies del gen 16S rRNA de Dehalogenimonas determinades per qPCR demostraren que la decloració de 1,2-dicloropropà (1,2-DCP) es produïa en paral·lel al creixement de Dehalogenimonas. L'anàlisi de l'isòtop de carboni durant la degradació de 1,2-DCP per Dehalogenimonas presenta un fraccionament isotòpic () de -15. 0 ± 0. 7 que és significativament diferent al d'altres soques de Dehalococcoides encara quetenen la mateixa dehalogenasa reductiva funcional (DcpA) implicada en la degradació de 1,2-DCP a propè. La correlació de fraccionament isotòpic obtingut per a la parella C-Cl (Ʌ = 1. 89 ± 0. 02) durant la dicloroeliminació de 1,2-DCA per Dehalogenimonas era significativament diferent tant dels obtinguts prèviament per Dehalococcoides catalitzant una reacció similar de dehaloeliminació com dels de l'oxidació aeròbia de 1,2-DCA. Aquests resultats serveixen per il·lustrar la potencialitat de l'ús del fraccionament isotòpic simultani del C-Cl per a diferenciar entre diferents mecanismes de reacció (oxidació, dehalogenació hidrolítica i dehaloeliminació) Desprès d'assolir el repte d'obtenir un cultiu estable, l'aïllament de Dehalogenimonas va ser el següent objectiu. Fins avui, només 3 especies del gènere Dehalogenimonas han estat aïllades i aquesta és la primera que es cultiva a Europa. Per abordar l'aïllament s'ha fet servir el mètode de dilució fins a l'extinció i l'addició d'antibiòtics selectius. Desprès de 13 transferències seqüencials d'aquest cultiu de partida alimentat amb 1,2-DCP i dues dilucions consecutives 1:107 seguides per l'addició d'estreptomicina durant 5 transferències, es va fer una genoteca que va demostrar que el cultiu estava format predominantment per Dehalogenimonas sp. (87%), però també hi havia Desulfovibrio sp. (12%) i una Vellonellaceac no classificada (1%). Actualment s'està continuant el treball en el nostre laboratori per assolir l'aïllament de Dehalogenimonas sp. En aquest estudi s'ha intentat fer una llista preliminar de dehalogenases reductives (RDase) candidates a estar involucrades en la transformació de 1,1,2-tricloroetà (1,1,2-TCA) i 1,2-dibromoetà (EDB) en Dehalogenimonas fent servir la tècnica de shotgun proteomics (LTQ-Orbitrap). A més a més, es van fer electrofòresis amb gel de poliacrilamida blau natiu (BN-PAGE) combinat amb assajos d'activitat decloradora per identificar la RDase responsable de la dicloroeliminació de 1,1,2-TCA. Encara que es va detectar activitat decloradora en una banda del gel, no es va identificar la RDase ni per cromatografia líquida acoblat amb un espectròmetre de masses (LC-MS/MS) ni per electroforesis en gel de poliacrilamida amb dodecil sulfat de sodi. L'absència de RDAse pot ser degut a vàries raons, entre elles la baixa concentració de proteïna i l'ús d'una base de dades que es va construir a partir d'anotacions dels genomes d'altres Dehalogenimonas, perquè la nostra soca no està encara seqüenciada. Finalment, es va construir un co-cultiu sintròfic de Dehalogenimonas i Dehalococcoides mccartyi per tal d'assolir la completa detoxificació de 1,1,2-TCA fins a etè. En aquest co-cultiu, Dehalogenimonas transforma 1,1,2-TCA via dihaloeliminació a clorur de vinil, alhora que Dehalococcoides redueix el clorur de vinil via hidrogenòlisis a etè. S'ha fet un canvi d'escala a un reactor anaerobi de 5 L operant en semicontinu. En aquest estudi es demostra, a partir d'una combinació sintètica de bacteris, la capacitat de detoxificar 1,1,2-TCA quan aquests microorganismes presenten capacitats metabòliques complementàries.
Resum: Halogenated compounds (organohalides) are recalcitrant organic compounds, exhibiting toxic effects on human health and the ecosystem. In this study, we aimed to obtain an enrichment culture containing organohalide-respiring bacteria able to transform halogenated alkanes. A stable nonmethanogenic enriched anaerobic culture that exclusively dehalogenates vicinally chlorinated and brominated alkanes via dihaloelimination was established from Besòs River estuary sediments (Barcelona, Spain). Application of genus specific primers targeting 16S rRNA gene sequences together with the observation of physiological characteristics of the dechlorinating culture indicated that a Dehalogenimonas strain was the responsible for chlorinated alkane degradation in the microcosms. The increase of Dehalogenimonas 16S rRNA gene copies using quantitative PCR (qPCR) revealed that 1,2-dichloropropane (1,2-DCP) dechlorination was coupled to Dehalogenimonas growth in this culture. Carbon and dual carbon-chlorine (C-Cl) isotope fractionation during anaerobic biodegradation of 1,2-DCP and 1,2-dichloroethane (1,2-DCA), respectively, by Dehalogenimonas-containing enrichment culture were determined in this study. Compound specific isotope analysis revealed that the Dehalogenimonas-catalyzed carbon isotopic fractionation () of the 1,2-DCP-to-propene reaction was −15. 0 ± 0. 7‰ and differs significantly from other Dehalococcoides strains eventhough they harbored the same functional reductive dehalogenase (DcpA) for 1,2-DCP-to-propene dechlorination. The dual element C-Cl isotope correlation obtained (Ʌ = 1. 89 ± 0. 02) during 1,2-DCA-to-ethene dichloroelimination by Dehalogenimonas was significantly discernible from those reported for Dehalococcoides catalyzing a similar dihaloelimination reaction and aerobic oxidation. This illustrates the potential use of dual C-Cl isotope approach to distinguish between different degradation pathways (oxidation, hydrolytic dehalogenation and dihaloelimination). After overcoming the challenges in developing a stable culture, isolation of Dehalogenimonas became the next objective. To date, only three species belonging to Dehalogenimonas genus have been isolated and this study constituted the first evidence of a Dehalogenimonas culture enriched in Europe. The isolation approach consisted of the dilution to extinction method and the addition of selected antibiotics. After thirteen sequential transfer of this culture fed with 1,2-DCP-to-propene and two consecutive 10-7 dilutions followed by the addition of streptomycin for five transfers, a clone library of bacterial amplicons revealed that Dehalogenimonas sp. constituted 87 % of the predominant bacteria, followed by Desulfovibrio sp. (12 %) and unclassified Veillonellaceae (1. 2%). Further work is currently underway in our lab to isolate the Dehalogenimonas sp. In this study, a preliminary list of reductive dehalogenase (RDase) candidates involved in the transformation of 1,1,2-trichloroethane (1,1,2-TCA) and 1,2-dibromoethane (EDB) by this Dehalogenimonas culture was attempted using shotgun proteomics analysis (LTQ-Orbitrap). In addition, blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) approach combined with dechlorination activity assays were performed to identify the RDase responsible for 1,1,2-TCA dichloroelimination. Eventhough dechlorination activity was detected in a gel slice of the BN-PAGE of the culture growing with 1,1,2-TCA, no RDase was identified by neither liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis nor sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The absence of RDase can be due to several reasons including low protein content and the use of a database constructed from the published genomic annotations of other isolated Dehalogenimonas because our strain was not sequenced yet. Finally, a syntrophic co-culture of Dehalogenimonas and Dehalococcoides mccartyi strains to achieve complete detoxification of 1,1,2-TCA to ethene was also constructed. In this co-culture, Dehalogenimonas transformed 1,1,2-TCA via dihaloelimination to vinyl chloride, whereas Dehalococcoides reduced vinyl chloride via hydrogenolysis to ethene. Scale up of the cultivation to a 5-L bioreactor operating in fed-batch mode and the synthetic combination of these bacteria with known complementary metabolic capabilities was demonstrated.
Nota: Doctorat
Nota: Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental
Nota: 2017
Nota: Tesi
Drets: L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons Creative Commons
Llengua: Anglès.
Document: Tesis i dissertacions electròniques ; doctoralThesis ; publishedVersion
Matèria: Compostos orgànics halogenats ; Anaerobiosi ; Alcans
ISBN: 9788449070495

Adreça alternativa: http://hdl.handle.net/10803/405243


220 p, 3.1 MB

El registre apareix a les col·leccions:
Documents de recerca > Tesis doctorals

 Registre creat el 2018-02-05, darrera modificació el 2018-02-07



   Favorit i Compartir