| Resumen: |
ScFv-h3D6 és un fragment variable de cadena lleugera, derivat de l'anticòs bapineuzumab, capaç d'evitar la citotoxicitat induïda pel pèptid Aβ, retirant els oligòmers de la via amiloide cap a una via d'agregació worm-like (WL). A més, s'ha demostrat que és eficaç a nivell cognitiu, cel·lular i molecular en el tractament del model murí d'Alzheimer 3xTg-AD. Tot i el seu gran potencial, la producció del scFv-h3D6 estava limitada per alguns colls d'ampolla com la presència de conformacions scrambled i la seva contaminació amb endotoxines, que reduïen el rendiment de producció i n'augmentaven el cost. En el present treball, diverses formes per millorar la producció i l'estabilitat termodinàmica han estat explorades. En primer lloc, els ponts disulfur s'han eliminat per tal d'evitar conformacions scrambled i, d'aquesta manera, millorar el rendiment de purificació de la proteïna, assegurant una conformació homogènia. L'eliminació del pont disulfur del domini més estable, va resoldre el problema de l'scrambled, duplicant el rendiment de producció. També es va canviar la ruta d'agregació des de la morfologia de protecció WL a una amiloide. Després, es va estabilitzar el scFv-h3D6 mitjançant la introducció de la mutació VH-K64R i combinant-la amb l'extensió anteriorment descrita (C3). Les estabilitats de les diferents construccions del scFv-h3D6 van resultar en l'ordre C3> K64R / C3> VH-K64R ≥ scFv-h3D6, demostrant que la combinació d'ambdues mutacions no era additiva sinó que es cancel·laven parcialment entre si. En els assajos de citotoxicitat, tots els mutants evitaven la citotoxicitat del pèptid Aβ d'una manera dependent de la dosi i amb eficiències que es correlacionaven amb l'estabilitat. Finalment, es va realitzar un canvi en el sistema d'expressió del scFv-h3D6: d'Escherichia coli a Pichia Pastoris. A més de mantenir les mateixes propietats termodinàmiques, es van millorar d'altres: homogeneïtat de la mostra, l'absència de conformacions scrambled, mostra lliure d'endotoxines, un millor rendiment i fàcil extrapolació a una escala més gran. L'eficàcia terapèutica es va demostrar in vitro i in vivo. D'altra banda, la immunoteràpia contra el pèptid Aβ ha estat molt estudiada, però no com altres molècules implicades en la malaltia d'Alzheimer poden afectar al rendiment de l'anticòs. Per entendre completament les possibles interaccions i efectes entre Aβ, scFv-h3D6, apoE i apoJ; es va realitzar un estudi complet des de diferents perspectives: biofísica, cel·lular i in vivo. Enlloc d'apolipoproteïnes senceres, es va combinar el scFv-h3D6 amb els pèptids mimètics (MP) de les apolipoproteïnes (apo) E i J, compostos d'estructures essencials per a la unió a altres molècules. Els estudis biofísics van mostrar que el apoE-MP impedia la formació de les fibres WL pel complex scFv-h3D6/Aβ i parcialment interferia en la reducció induïda per scFv-h3D6 en la captació d'Aβ pels astròcits; mentre que el apoJ-MP permetia la formació de fibres WL i no interferia en la captació d' Aβ. En mirar la inflamació associada amb l'Alzheimer, el apoE-MP va desenvolupar un paper antiinflamatori en cultiu cel·lular i en el model de ratolí 3xTg-AD; mentre apoJ-MP va mostrar un perfil antiinflamatòri només quan es combinava amb scFv-h3D6. ScFv-h3D6 sol no va induir l'activació microglial, prèviament observada amb anticossos complets, sinó més aviat la va reduir. Els nivells d'apoE i J es van reduir amb el scFv-h3D6, però van augmentar amb apoE-MP i apoJ-MP. Com a conclusió general, el tractament amb scFv-h3D6 disminueix la càrrega d'Aβ, disminueix la captació d' Aβ en astròcits, restaura els nivells de apoE i apoJ endògens i redueix la inflamació. Encara que la teràpia combinada amb MPs s'ha d'analitzar més, aquest treball demostra que tots els efectes del scFv-h3D6 estan dirigits a prevenir la patologia de l'Alzheimer, sense provocar els efectes perjudicials que es mostren amb el bapineuzumab en assajos clínics. |
visitante ::
identificación
dir.
