| Data: |
2025 |
| Resum: |
En les plantes, els petits ARN (sRNA) exerceixen un paper fonamental en la regulació de l'expressió gènica i en el manteniment de la integritat del genoma. No obstant això, les vies de processament i els orígens cel·lulars de molts sRNA endògens continuen sent poc caracteritzats. Aquesta tesi investiga la biogènesi, el processament i la localització compartimental dels transcrits productors de sRNA en Arabidopsis thaliana, amb un enfoc especial en DICER-LIKE 3 (DCL3), l'enzim nuclear principalment responsable de generar sRNA de 24 nucleòtids implicats en la silenciació gènica transcripcional (TGS). Per identificar directament els substrats endògens de DCL3, vaig establir un protocol rigorós de coimmunoprecipitació combinat amb seqüenciació profunda dels sRNA units a una forma catalíticament inactiva de DCL3 (DCL3ci). Aquest enfoc va permetre analitzar i caracteritzar, per primera vegada de manera directa, els substrats de DCL3. Tal com s'esperava, la majoria dels transcrits associats a DCL3 provenen d'elements transposables (TEs) i depenen en gran mesura de l'ARN POLIMERASA IV (Pol IV) i de l'ARN-DEPENDENT ARN POLIMERASA 2 (RDR2). Es van observar patrons d'interacció diferenciats entre les superfamílies de TE, la qual cosa reflecteix diferències en l'origen o l'estructura dels precursors. A més, vam caracteritzar un conjunt divers de substrats no canònics, incloent-hi precursors estructurats com ara loci transcrits per l'ARN polimerasa II, ARN no codificants independents de RDR2 i miARN joves. Aquests precursors generen sRNA funcionals de 24-nt capaços de carregar-se en proteïnes ARGONAUTE (AGO), suggerint la seva participació en la silenciació gènica a través de mecanismes no canònics dependents de DCL3. De manera destacada, MIR168a va emergir com el locus amb més interacció amb DCL3ci. Donat que miR168a regula AGO1, l'efector central de la silenciació gènica post-transcripcional (PTGS), aquesta associació inesperada suggereix una possible interacció entre TGS i PTGS. En paral·lel, vaig establir un enfoc transcriptòmic mitjançant la classificació de nuclis activada per fluorescència (FANS) per enriquir ARN nuclear, permetent un perfilat precís de l'ARN del compartiment nuclear. Aquesta anàlisi va revelar centenars de loci enriquits, incloent-hi ARN nuclears derivats de llocs d'empalmament (splice junctions) i ARN llargs no codificants antisentit (aslncRNA). A més, entre els ARN nuclears enriquits vam recuperar substrats units a DCL3, cosa que indica punts específics de convergència entre la localització dels transcrits i l'accessibilitat a DCL3. Aquest treball aporta avenços conceptuals i tècnics per a la identificació dels substrats endògens de DCL3 i amplia la nostra comprensió de la biogènesi dels sRNA més enllà dels paradigmes canònics de silenciació. |
| Resum: |
En las plantas, los pequeños ARN (sRNA) desempeñan un papel crucial en la regulación de la expresión génica y en el mantenimiento de la integridad del genoma. Sin embargo, las vías de procesamiento y los orígenes celulares de muchos sRNA endógenos siguen estando poco caracterizados. Esta tesis investiga la biogénesis, el procesamiento y la localización compartimental de los transcritos productores de sRNA en Arabidopsis thaliana, centrándose particularmente en DICER-LIKE 3 (DCL3), la enzima nuclear responsable principalmente de generar sRNA de 24 nucleótidos implicados en la silenciación génica transcripcional (TGS). Para identificar directamente los sustratos endógenos de DCL3, establecí un protocolo riguroso de co-inmunoprecipitación acoplado a secuenciación profunda de sRNA unidos a una forma catalíticamente inactiva de DCL3 (DCL3ci). Este enfoque permitió analizar y caracterizar, por primera vez de manera directa, los sustratos de DCL3. Como era de esperar, la mayoría de los transcritos asociados a DCL3 provienen de elementos transponibles (TEs) y dependen en gran medida de la ARN POLIMERASA IV (Pol IV) y de la ARN-DEPENDIENTE ARN POLIMERASA 2 (RDR2). Se observaron patrones de interacción distintos entre superfamilias de TE, lo que refleja diferencias en el origen o la estructura de los precursores. Además, caracterizamos un conjunto diverso de sustratos no canónicos, incluidos precursores estructurados como loci transcritos por la ARN Polimerasa II, ARN no codificantes independientes de RDR2 y miRNA jóvenes. Estos precursores generan sRNA funcionales de 24-nt capaces de cargarse en proteínas ARGONAUTE (AGO), lo que sugiere su participación en la silenciación génica a través de mecanismos no canónicos dependientes de DCL3. De manera notable, MIR168a surgió como el locus con mayor interacción con DCL3ci. Dado que miR168a regula AGO1, el efector central de la silenciación génica post-transcripcional (PTGS), esta asociación inesperada sugiere un posible crosstalk entre TGS y PTGS. En paralelo, desarrollé un enfoque transcriptómico basado en la clasificación de núcleos activada por fluorescencia (FANS) para enriquecer ARN nuclear, lo que permitió un perfilado preciso del ARN procedente del compartimento nuclear. Este análisis reveló cientos de loci enriquecidos, incluidos ARN nucleares derivados de uniones de empalme (splice junctions) y ARN largos no codificantes antisentido (aslncRNA). Asimismo, recuperamos entre los ARN nucleares enriquecidos algunos sustratos asociados a DCL3, lo que indica puntos específicos de convergencia entre la localización de los transcritos y la accesibilidad a DCL3. Este trabajo aporta avances conceptuales y técnicos para la identificación de sustratos endógenos de DCL3 y amplía nuestra comprensión de la biogénesis de sRNA más allá de los paradigmas canónicos de silenciación. |
| Resum: |
In plants, small RNAs (sRNAs) play a critical role in regulating gene expression and maintaining genome integrity. However, the processing routes and cellular origins of many endogenous sRNAs remain poorly characterized. This thesis investigates the biogenesis, processing, and compartmental localization of sRNA-producing transcripts in Arabidopsis thaliana, focusing particularly on the nuclear DICER-LIKE 3 (DCL3), the enzyme primarily responsible for generating 24-nucleotide small RNAs involved in Transcriptional Gene Silencing (TGS). To directly identify endogenous DCL3 substrates, I established a stringent co-immunoprecipitation protocol coupled with deep sequencing of sRNAs bound to a catalytically inactive form of DCL3 (DCL3ci). This approach allowed me to analyze and characterize, for the first time, the DCL3 substrate in a direct manner. As expected, most DCL3-associated transcripts arise from transposable elements (TEs), largely dependent on RNA POLYMERASE IV (Pol IV) and RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDR2). Distinct interaction patterns were observed across TE superfamilies, reflecting differences in precursor origin or structure. In addition, we characterized a diverse set of non-canonical substrates, including structured precursors such as RNA Polymerase II-transcribed loci, RDR2-independent non-coding RNAs, and young miRNAs. These precursors generate functional 24-nt sRNAs capable of ARGONAUTE (AGO) protein loading, suggesting their participation in gene silencing via non-canonical DCL3-dependent mechanisms. Strikingly, MIR168a emerged as the strongest DCL3ci-interacting locus. Given that miR168a regulates AGO1, the central effector of post-transcriptional gene silencing (PTGS), this unexpected association suggests a potential crosstalk between TGS and PTGS. In parallel, I established a transcriptomic approach using fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) to enrich nuclear RNA, enabling precise RNA profiling from the nuclear compartment. This analysis uncovered hundreds of enriched loci, including nuclear RNA derived from splicing junctions and antisense long non-coding RNAs (aslncRNAs). We also recovered among nuclear-enriched RNA, DCL3-bound substrates, indicating specific points of convergence between transcript localization and DCL3 accessibility. This work introduces both conceptual and technical advances for the identification of endogenous DCL3 substrates and broadens our understanding of sRNA biogenesis beyond canonical silencing paradigms. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegetal |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Col·lecció: |
Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegetal |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
Biogènesi de sRNA ;
SRNA biogenesis ;
Biogénesis de sRNA ;
Ciències Experimentals |
visitant ::
identificació
dir.
