| Date: |
2025 |
| Abstract: |
La meiosi és un procés biològic que permet la reorganització del material genètic per transmetre'l a la descendència. Està estrictament controlat per diversos processos per assegurar una segregació cromosòmica adequada en gàmetes per tal de preservar l'estabilitat genòmica. Durant la recombinació meiòtica s'introdueixen centenars de trencaments programats de doble cadena d'ADN (DSB), fent de la meiosi un model ideal per estudiar la recombinació homòloga. L'AAA+ ATPasa TRIP13 ha estat prèviament implicada en diversos processos cel·lulars, incloent-hi la reparació de danys a l'ADN, la regulació del checkpoint de l'assemblatge del fus, el silenciament meiòtic de la cromatina no sinapsada i l'organització de l'eix cromosòmic meiòtic. No obstant això, encara es desconeix com TRIP13 regula la recombinació meiòtica. En aquest context, aquesta tesi pretén: (i) estudiar algunes proteïnes de l'interactoma de TRIP13 que poden explicar les seves funcions meiòtiques; (ii) analitzar com TRIP13 està involucrat en la reparació del DSB durant la profase meiòtica; i (iii) analitzar com la funció TRIP13 ATPasa està involucrada en la gametogènesi, la sinapsi i la recombinació. Per fer-hi front, vam analitzar proteïnes que co-immunoprecipitaven amb TRIP13 del testis de ratolí per descobrir nous interactors. A més, vam aplicar tècniques citològiques i histològiques tradicionals, combinades amb mètodes d'alta resolució més nous per estudiar la cromatina, incloent-hi ChIP-seq, seqüenciació d'ADN monocatenari (ssDNA) i Exo7/T-seq. Els nostres resultats van revelar múltiples proteïnes que interaccionen amb TRIP13 que podrien ajudar a explicar el seu paper en la meiosi. En concret, mostrem que TRIP13 regula la localització de HSPA2 durant la profase meiòtica, que és necessària per completar la sinapsi dels cromosomes homòlogues. A més, TRIP13 influeix en la localització durant la profase dels cofactors de la recombinasa RAD51, SFR1 i BOD1L, proporcionant una visió mecanicista dels defectes de càrrega de RAD51 observats en els espermatòcits amb dèficit de TRIP13. En particular, vam revelar que existeix un fenotip d'hiperresecció del ssDNA en absència de TRIP13, suggerint un nou paper per TRIP13 en el control de resecció durant la meiosi. Els resultats de TRIP13 ChIP-seq, els perfils de distribució de RPA al llarg dels extrems reseccionats i les mesures de la longitud de la resecció en els mutants Trip13-/- donen suport a aquesta idea. Finalment, vam investigar la rellevància funcional de l'activitat ATPasa de TRIP13. Sorprenentment, l'activitat d'ATPasa era prescindible per a la càrrega de RPA i RAD51 a les DSB durant la meiosi, suggerint un possible paper de bastida de la proteïna més enllà de la seva funció canònica. Utilitzant un model condicional de ratolí Trip13 ATPase-dead, vam detectar que la funció ATPasa de TRIP13 està implicada en la maduració d'entrecreuaments, probablement a través de la regulació d'altres elements del complex sinaptonèmic, com pot ser HORMAD1. |
| Abstract: |
La meiosis es un proceso biológico que permite la reorganización del material genético para transmitirlo a la descendencia. Se encuentra estrictamente controlado por diversos procesos para asegurar una segregación cromosómica adecuada en los gametos con el fin de preservar la estabilidad genómica. Durante la recombinación meiótica se producen cientos de roturas programadas en doble cadena de ADN (DSBs), lo que convierte a la meiosis en un modelo ideal para estudiar la recombinación homóloga. Se ha descrito la implicación de la AAA+ ATPasa TRIP13 en diversos procesos celulares, incluyendo la reparación de daños en el ADN, la regulación del checkpoint del ensamblaje del huso, el silenciamiento meiótico de la cromatina no sinapsada y la organización del eje cromosómico meiótico. Sin embargo, aún se desconoce cómo TRIP13 regula la recombinación meiótica. En este contexto, esta tesis pretende: (i) estudiar algunas proteínas del interactoma de TRIP13 que pueden explicar sus funciones meióticas; (ii) analizar cómo TRIP13 está involucrado en la reparación de DSBs durante la profase meiótica; y (iii) analizar cómo la función ATPasa de TRIP13 está relacionada con la gametogénesis, la sinapsis y la recombinación. Para ello, analizamos proteínas que co-inmunoprecipitaban con TRIP13 en muestras de testículo de ratón para descubrir nuevos interactores. Además, aplicamos técnicas citológicas e histológicas tradicionales, combinadas con métodos de alta resolución más novedosos para estudiar la cromatina, incluyendo ChIP-seq, secuenciación de ADN monocatenario (ssDNA) y Exo7/T-seq. Nuestros resultados revelaron múltiples proteínas que interactúan con TRIP13 y que podrían ayudar a explicar su papel en la meiosis. En concreto, demostramos que TRIP13 regula la localización de HSPA2 durante la profase meiótica, lo cual es necesario para completar la sinapsis de los cromosomas homólogos. Además, TRIP13 influye en la localización durante la profase de los cofactores de la recombinasa RAD51, SFR1 y BOD1L, proporcionando una explicación mecanicista de los defectos de carga de RAD51 observados en los espermatocitos con déficit de TRIP13. En particular, revelamos un fenotipo de hiperresección del ssDNA en ausencia de TRIP13, lo que sugiere un nuevo papel para TRIP13 en el control de la resección durante la meiosis. Los resultados de ChIP-seq de TRIP13, los perfiles de distribución de RPA a lo largo de los extremos reseccionados y las medidas de la longitud de la resección en los mutantes Trip13-/- respaldan esta idea. Finalmente, investigamos la relevancia funcional de la actividad ATPasa de TRIP13. Sorprendentemente, la actividad ATPasa era prescindible para la carga de RPA y RAD51 en las DSBs durante la meiosis, lo cual sugiere un posible papel de andamiaje de la proteína más allá de su función canónica. Utilizando un modelo condicional de ratón Trip13 ATPase-dead, detectamos que la función ATPasa de TRIP13 está implicada en la maduración de los entrecruzamientos, probablemente a través de la regulación de otros elementos del complejo sinaptonémico, como puede ser HORMAD1. |
| Abstract: |
Meiosis is a biological process that enables the reshuffling of the genetic material to transmit it to the offspring. It is strictly controlled by several processes to ensure proper chromosomal segregation into gametes in order to preserve genomic stability. During meiotic recombination, hundreds of programmed DNA double-strand breaks (DSBs) are introduced, making meiosis an ideal model for studying homologous recombination. The AAA+ ATPase TRIP13 has been previously implicated in several cellular processes, including DNA damage repair, spindle assembly checkpoint regulation, meiotic silencing of unsynapsed chromatin, and meiotic chromosomal axis organisation. However, it is still unknown how TRIP13 regulates meiotic recombination. In this context, this thesis aims to: (i) study some proteins from the TRIP13 interactome that may explain TRIP13 meiotic functions; (ii) analyse how TRIP13 is involved in the DSB repair during meiotic prophase; and (iii) analyse how the TRIP13 ATPase function is involved in gametogenesis, synapsis and recombination. To address this, we analysed proteins that co-immunoprecipitated with TRIP13 from mouse testis to uncover novel TRIP13 interactors. Additionally, we employed traditional cytological and histological techniques, as well as novel high-resolution methods, to study chromatin, including ChIP-seq, single-stranded DNA (ssDNA) sequencing, and Exo7/T-seq. Our results revealed multiple TRIP13-interacting proteins that could help explain its role in meiosis. In particular, we show that TRIP13 regulates HSPA2 localisation during meiotic prophase, which is necessary to complete homologous chromosome synapsis. In addition, TRIP13 influences the RAD51 recombinase cofactors SFR1 and BOD1L localisation during prophase, providing a mechanistic insight into RAD51 loading defects observed in TRIP13-deficient spermatocytes. Notably, we revealed a hyper-resection phenotype of the ssDNA ends in the absence of TRIP13, suggesting a novel role for TRIP13 in resection control during meiosis. Results from TRIP13 ChIP-seq, RPA distribution profiles along the resected ends and resection length measurements in Trip13-/- mutants support this idea. Finally, we investigated the functional relevance of TRIP13's ATPase activity. Surprisingly, ATPase activity was dispensable for RPA and RAD51 loading into the DSBs during meiosis, suggesting a possible scaffolding role of the protein beyond its canonical function. Using a conditional Trip13 ATPase-dead mouse model, we found that the TRIP13 ATPase function is involved in crossover maturation, most likely through the regulation of other synaptonemal complex elements such as HORMAD1. |
| Abstract: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia Cel·lular. |
| Rights: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra, i la creació d'obres derivades, sempre que no sigui amb finalitats comercials i que es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original. Cal que es reconegui l'autoria de l'obra original.  |
| Language: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Subject: |
Meiosi ;
Meiosis ;
Trencaments de doble cadena ;
DNA Double Strand Breaks ;
Roturas de doble cadena de ADN ;
Recombinació homòloga ;
Homologous recombination ;
Recombinación homóloga ;
Ciències Experimentals |
guest ::
