| Data: |
2025 |
| Resum: |
El Complex Principal d'Histocompatibilitat (MHC), o HLA en humans, codifica glicoproteïnes de membrana que s'agrupen en MHC de classe I i classe II. Les molècules de classe I presenten pèptids derivats de proteïnes citosòliques i nuclears als limfòcits T CD8+, mentre que les molècules de classe II presenten pèptids de proteïnes extracel·lulars als limfòcits T CD4+. Per poder ser presentades per MHC-I, les proteïnes citosòliques han de ser degradades principalment pel proteasoma, component central del Sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS), que degrada proteïnes poliubiquitinades. Els pèptids generats es transporten al reticle endoplasmàtic, s'incorporen a HLA-I i es presenten als limfòcits T CD8+. El nucli catalític del proteasoma 20S consta de quatre anells heptamèrics: dos exteriors α i dos interiors β, sent les subunitats catalítiques β1, β2 i β5. Existeixen variants: immunoproteasoma (β1i, β2i, β5i), timoproteasoma (β1i, β2i, β5t), espermatoproteasoma (α4s) i proteasomes intermedis (SIP: β1, β2, β5i; DIP: β1i, β2, β5i). La presència de diferents subunitats catalítiques produeix una especificitat diferent i hauria d'implicar canvis en els immunopeptidomes associats a MHC-I. A la primera part de la tesi es va analitzar l'immunopeptidoma generat pel SIP i es va caracteritzar la seva estructura 20S. Es van utilitzar les línies cel·lulars HEK-293 i HEK-293F expressant exclusivament el proteasoma constitutiu o el SIP. L'anàlisi de l'immunopeptidoma va mostrar diferències en la composició: el SIP generava més pèptids amb residus aromàtics i bàsics, i menys Ala i Val en la posició PΩ. Assajos d'activitat catalítica amb pèptids fluorogènics van demostrar que el SIP és més eficient cortant després de Trp i Arg, mentre que el proteasoma constitutiu cortava millor després d'Ala. L'estructura per Cryo-EM va revelar que β5i té un pocket S1 més ampli, afavorint residus aromàtics. Aquests resultats indiquen que el SIP modifica els pèptids presentats per HLA-I, influenciant la resposta immune. A la linia HEK-293F, l'anàlisi de l'immunopeptidoma va mostrar absència de pèptids amb extrem C-terminal bàsic. Es va estudiar la presència de HLA-A*03:01, que uneix pèptids bàsics, mitjançant qPCR, mostrant mRNA present, però l'anàlisi per citometria de flux va indicar absència d'aquesta molècula en la superfície cel·lular, explicant la manca d'aquests pèptids a l'immunopeptidoma. La segona part de la tesi va estudiar subpeptidomes en molècules HLA-I del supertipus B7. L'anàlisi in silico de 13 alotips va mostrar subpeptidomes amb Pro2 i residus hidrofòbics a P1 o Ala2 i residus polars/àcids a P1 (HLA-B51:01, -B51:08, -B54:01, -B35:01, -B35:03, -B35:07, -B53:01), mentre que altres no els presentaven (HLA-B07:02, -B07:04, -B42:01, -B55:01, -B55:02, -B56:01). Dades publicades suggereixen que la presència de determinats residus a les posicions 45 i 67 (polimòrfiques en aquest supertipus) és rellevant per a la presència d'Ala2. La mutagènesi dirigida en HLA-B51:01, HLA-B35:01 i HLA-B07:02 va mostrar que Thr45 i Phe67 afavoreixen un percentatge més alt d'Ala2 i subpeptidomes, mentre que Glu45 i Tyr67 restringeixen el pocket a Pro2 i sense subpeptidomes. Tot i que aquestes posicions no són essencials per a la presència de subpeptidomes, sí condicionen l'abundància de pèptids amb Ala2. En conjunt, la tesi demostra que la composició dels proteasomes i les variants en HLA-I determinen l'especificitat i diversitat de l'immunopeptidoma, cosa que pot influir en la presentació antigènica i la resposta immune. |
| Resum: |
El Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), o HLA en humanos, codifica glicoproteínas de membrana que se agrupan en MHC de clase I y clase II. Las moléculas de clase I presentan péptidos derivados de proteínas citosólicas y nucleares a los linfocitos T CD8+, mientras que las moléculas de clase II presentan péptidos de proteínas extracelulares a los linfocitos T CD4+. Para ser presentadas por MHC-I, las proteínas citosólicas deben ser previamente degradadas, principalmente por el proteasoma, componente central del Sistema Ubiquitín-Proteasoma (UPS), que degrada proteínas poliubiquitinadas. Los péptidos generados se transportan al retículo endoplasmático, se cargan en HLA-I y se presentan a los linfocitos T CD8+. El núcleo catalítico del proteasoma 20S consta de cuatro anillos heptaméricos: dos exteriores α y dos interiores β, siendo las subunidades catalíticas β1, β2 y β5. Existen variantes: inmunoproteasoma (β1i, β2i, β5i), timoproteasoma (β1i, β2i, β5t), espermatoproteasoma (α4s) y proteasomas intermedios (SIP: β1, β2, β5i; DIP: β1i, β2, β5i). La presencia de diferentes subunidades catalíticas produce una especificidad diferente y debería implicar cambios en los inmunopeptidomas asociados a MHC-I. En la primera parte de la tesis se analizó el inmunopeptidoma generado por el SIP y se caracterizó su estructura 20S. Se usaron las líneas celulares HEK-293 y HEK-293F expresando exclusivamente el proteasoma constitutivo o el SIP. El análisis del inmunopeptidoma mostró diferencias en su composición: el SIP generaba más péptidos con residuos aromáticos y básicos, y menos Ala y Val en posición PΩ. Ensayos de evaluación de la actividad catalítica con péptidos fluorogénicos demostraron que el SIP es más eficiente cortando tras Trp y Arg, mientras que el proteasoma constitutivo cortaba mejor tras Ala. La estructura por Cryo-EM reveló que β5i tiene un pocket S1 más amplio, favoreciendo residuos aromáticos. Estos hallazgos indican que el SIP modifica los péptidos presentados por HLA-I, influyendo en la respuesta inmune. En la línea celular HEK-293F, el análisis del inmunopeptidoma de clase I mostró ausencia de péptidos con extremo C-terminal básico. Se analizó la presencia de HLA-A*03:01, que une péptidos básicos, por qPCR y mostró mRNA presente, pero el análisis por citometría de flujo indicó ausencia de esta molécula en superficie celular, explicando la ausencia de esos péptidos en el inmunopeptidoma. La segunda parte de la tesis analizo la presencia de subpeptidomas en moléculas de HLA-I del supertipo B7. El análisis in silico de 13 alotipos mostró subpeptidomas con Pro2 y residuos hidrofóbicos en P1 o Ala2 y residuos polares/ácidos en P1 (HLA-B*51:01, -B*51:08, -B*54:01, -B*35:01, -B*35:03, -B*35:07, -B*53:01), mientras que otros no los presentaban (HLA-B*07:02, -B*07:04, -B*42:01, -B*55:01, -B*55:02, -B*56:01). Datos publicados sugieren que la presencia de determinados residuos en las posiciones 45 y 67 (polimórficas en este supertipo) son relevantes en la presencia de Ala2. La mutagénesis dirigida en HLA-B*51:01, HLA-B*35:01 y HLA-B*07:02 mostró que Thr45 y Phe67 favorecen mayor porcentaje de Ala2 y subpeptidomas, mientras Glu45 y Tyr67 restringen el pocket a Pro2 y sin subpeptidomas. Aunque estas posiciones no son esenciales para la presencia de subpeptidomas, sí condicionan la abundancia de péptidos con Ala2. En conjunto, la tesis demuestra que la composición del proteasomas y variantes en HLA-I determinan la especificidad y diversidad del inmunopeptidoma, lo que puede influir en la presentación antigénica y la respuesta inmune. |
| Resum: |
The Major Histocompatibility Complex (MHC), or HLA in humans, encodes membrane glycoproteins grouped into class I and class II MHC molecules. Class I molecules present peptides derived from cytosolic and nuclear proteins to CD8+ T lymphocytes, while MHC-II presents peptides from extracellular proteins to CD4+ T lymphocytes. To be presented by MHC-I, cytosolic proteins must be degraded mainly by the proteasome, the central component of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS), which degrades polyubiquitinated proteins. The resulting peptides are transported to the endoplasmic reticulum, loaded onto HLA-I, and presented to CD8+ T lymphocytes. The catalytic core of the 20S proteasome consists of four heptameric rings: two outer α rings and two inner β rings, with catalytic activity residing in β1, β2, and β5 subunits. Variants exist: immunoproteasome (β1i, β2i, β5i), thymoproteasome (β1i, β2i, β5t), spermatoproteasome (α4s), and intermediate proteasomes (SIP: β1, β2, β5i; DIP: β1i, β2, β5i). The presence of different catalytic subunits produces distinct specificity, which is expected to alter MHC-I-associated immunopeptidomes. The first part of this thesis analyzed the immunopeptidome generated by the SIP and characterized its 20S structure. HEK-293 and HEK-293F cell lines were used, expressing exclusively the constitutive proteasome or the SIP. Immunopeptidome analysis revealed compositional differences: SIP generated more peptides with aromatic and basic residues and fewer Ala and Val at the PΩ position. Catalytic activity assays using fluorogenic peptides showed that SIP was more efficient at cleaving after Trp and Arg, while the constitutive proteasome was more efficient after Ala. Cryo-EM structure analysis revealed that β5i has a wider S1 pocket, favoring aromatic residues. These findings indicate that SIP modifies the peptides presented by HLA-I, influencing the immune response. In HEK-293F cell lines, the immunopeptidome analysis showed the absence of peptides with basic C-terminal residues. HLA-A*03:01, which binds basic peptides, was analyzed by qPCR, showing detectable mRNA, but flow cytometry indicated absence of the molecule on the cell surface, explaining the lack of these peptides in the immunopeptidome. The second part of the thesis studied subpeptidomes in HLA-I molecules of the B7 supertype. In silico analysis of 13 allotypes showed subpeptidomes with Pro2 and hydrophobic residues at P1 or Ala2 and polar/acidic residues at P1 (HLA-B51:01, -B51:08, -B54:01, -B35:01, -B35:03, -B35:07, -B53:01), while others did not present them (HLA-B07:02, -B07:04, -B42:01, -B55:01, -B55:02, -B56:01). Published data suggest that residues at positions 45 and 67 (polymorphic in this supertype) are relevant for Ala2 presence. Directed mutagenesis in HLA-B51:01, HLA-B35:01, and HLA-B07:02 showed that Thr45 and Phe67 favor a higher percentage of Ala2 and subpeptidomes, while Glu45 and Tyr67 restrict the pocket to Pro2 and no subpeptidomes. Although these positions are not essential for subpeptidome formation, they influence the abundance of Ala2-containing peptides. Overall, this thesis demonstrates that proteasome composition and HLA-I variants determine the specificity and diversity of the immunopeptidome, which may influence antigen presentation and the immune response. |
| Resum: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Immunologia Avançada. |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Castellà |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
Processament d'Antígen ;
Antigen Processing ;
Procesamiento de Antígeno ;
HLA de classe I ;
Class I HLA ;
HLA de clase I ;
Ciències de la Salut |
visitant ::
identificació
dir.
