| Date: |
2026 |
| Abstract: |
L'Hepatitis E és una malaltia inflamatòria del fetge causada pel virus de l'Hepatitis E (VHE), una de les principals causes d'hepatitis vírica aguda en el món. Encara que la majoria de les infeccions són autolimitades, la malaltia pot evolucionar cap a un estat crònic en pacients immunodeprimits, com els receptors de transplantament d'òrgans sòlids, i pot conduir a una fibrosi hepàtica progressiva i a cirrosi. Les guies clíniques actuals recomanen un tractament de tres mesos amb ribavirina (RBV) en monoteràpia. No obstant això, el fracàs terapèutic primari i la recaiguda viral continuen sent problemes importants, sobretot a causa de la manca d'alternatives antivirals aprovades. En aquesta tesi s'investiga el VHE com un virus estructurat en quasiespècies, una població dinàmica de variants estretament relacionades però genèticament diferents que existeixen com un "núvol de mutants", principalment a causa de l'absència de mecanismes de lectura i correcció d'errors en l'ARN polimerasa ARN dependent del virus (RdRp). Per entendre millor aquestes dinàmiques, hem establert un nou enfocament analític anomenat Quasispecies Fitness Fractions (QFF), que estratifica la població viral en quatre categories segons la freqüència dels haplotips: master, emergent, minoritaris i molt minoritaris. Mitjançant l'aplicació de la categorització QFF a dos pacients amb infecció crònica persistent per VHE que havien fracassat en diversos cicles de tractament amb RBV, hem identificat una discrepància significativa entre l'evolució genotípica i fenotípica quan el virus és sotmès a la pressió de la RBV. L'anàlisi longitudinal va revelar que mentre les poblacions virals es tornaven altament desestructurades a nivell de nucleòtids (genotípic) amb el genotip master representat per davall del 10%, es mantenien sorprenentment estables a nivell d'aminoàcids (fenotípic), amb el fenotip master representat entre el 60-80% de la població viral. Aquests resultats suggereixen que el VHE podria aprofitar les mutacions sinònimes per a preservar la funcionalitat proteica i la fitness viral, aprofitant l'efecte mutagènic del fàrmac com a catalitzador evolutiu, en compte d'evolucionar envers a una mutagènesi letal o "catàstrofe d'error". Per complementar els estudis de quasispecies, vàrem aplicar la metodologia de seqüenciació shotgun utilitzant mostres seqüencials del pacient del primer estudi, perquè havia mostrat un possible perfil de de resistència a la RBV després d'una segona exposició al fàrmac. Aquest enfocament va permetre identificar diferents substitucions associades a resistència dins del domini aminoacídic de la RdRp, incloent-hi D1384N i Y1587F. De manera rellevant, algunes d'aquestes mutacions eren detectables com a variants minoritàries a nivells sub-consens abans de convertir-se en dominants dins de la població o de contribuir al fracàs clínic del tractament. Des d'un punt de vista clínic, els nostres resultats suggereixen que la monoteràpia amb RBV, especialment en pacients amb càrregues virals elevades de VHE, podria afavorir la selecció de mutacions que incrementen la fitness viral. Per tant, les teràpies mutagèniques haurien de combinar-se idealment amb altres inhibidors antivirals capaços de reduir la càrrega viral, minimitzant la probabilitat per a la generació i selecció de resistències. A més, per a previndre les recaigudes virals, el tractament amb RBV s'hauria de mantindre fins que l'ARN del VHE siga indetectable en sèrum fent servir l'assaig més sensible disponible. Finalment, aquest treball de tesi reforça la importància clínica de la caracterització profunda de variants mitjançant seqüenciació de nova generació (NGS) com a eina predictiva precoç. El monitoratge de variants minoritàries a nivell sub-consens permet anticipar el fracàs terapèutic amb antelació, facilitant la interrupció primerenca de tractaments ineficaços i la implementació d'estratègies de medicina de precisió. La integració del mètode QFF amb l'anàlisi del genoma complet proporciona un marc sòlid per a comprendre la persistència viral i millorar els resultats terapèutics en la infecció crònica per VHE. |
| Abstract: |
La hepatitis E es una enfermedad inflamatoria del hígado causada por el virus de la hepatitis E (VHE), una de las principales causas de hepatitis vírica aguda en el mundo. Aunque la mayoría de las infecciones son autolimitadas, la enfermedad puede evolucionar hacia un estado crónico en pacientes inmunodeprimidos, como los receptores de trasplante de órganos sólidos, y puede conducir a una fibrosis hepática progresiva y a cirrosis. Las guías clínicas actuales recomiendan un tratamiento de tres meses con ribavirina (RBV) en monoterapia. Sin embargo, el fracaso terapéutico primario y la recaída viral continúan siendo problemas importantes, especialmente debido a la falta de alternativas antivirales aprobadas. En esta tesis se investiga el VHE como un virus estructurado en cuasiespecies, una población dinámica de variantes estrechamente relacionadas pero genéticamente diferentes que existen como una "nube de mutantes", principalmente debido a la ausencia de mecanismos de lectura y corrección de errores en la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus (RdRp). Para comprender mejor estas dinámicas, hemos establecido un nuevo enfoque analítico denominado Quasispecies Fitness Fractions (QFF), que estratifica la población viral en cuatro categorías según la frecuencia de los haplotipos: master, emergentes, minoritarios y muy minoritarios. Mediante la aplicación de la categorización QFF a dos pacientes con infección crónica persistente por VHE que habían fracasado en varios ciclos de tratamiento con RBV, hemos identificado una discrepancia significativa entre la evolución genotípica y fenotípica cuando el virus es sometido a la presión de la RBV. El análisis longitudinal reveló que, mientras las poblaciones virales se volvían altamente desestructuradas a nivel de nucleótidos (genotípico), con el genotipo master representado por debajo del 10 %, se mantenían sorprendentemente estables a nivel de aminoácidos (fenotípico), con el fenotipo master representando entre el 60 y el 80 % de la población viral. Estos resultados sugieren que el VHE podría aprovechar las mutaciones sinónimas para preservar la funcionalidad proteica y el fitness viral, utilizando el efecto mutagénico del fármaco como catalizador evolutivo, en lugar de evolucionar hacia una mutagénesis letal o "catástrofe de error". Para complementar los estudios de cuasiespecies, aplicamos la metodología de secuenciación shotgun utilizando muestras secuenciales del paciente del primer estudio, ya que había mostrado un posible perfil de desarrollo de resistencia a la RBV tras una segunda exposición al fármaco. Este enfoque permitió identificar diferentes sustituciones asociadas a resistencia dentro del dominio aminoacídico de la RdRp, incluyendo D1384N y Y1587F. De forma relevante, algunas de estas mutaciones eran detectables como variantes minoritarias a niveles sub-consenso antes de convertirse en dominantes dentro de la población o de contribuir al fracaso clínico del tratamiento. Desde un punto de vista clínico, nuestros resultados sugieren que la monoterapia con RBV, especialmente en pacientes con cargas virales elevadas de VHE, podría favorecer la selección de mutaciones que incrementan el fitness viral. Por tanto, las terapias mutagénicas deberían combinarse idealmente con otros inhibidores antivirales capaces de reducir la carga viral, minimizando la probabilidad de generación y selección de resistencias. Además, para prevenir las recaídas virales, el tratamiento con RBV debería mantenerse hasta que el ARN del VHE sea indetectable en suero utilizando el ensayo más sensible disponible. Finalmente, este trabajo de tesis refuerza la importancia clínica de la caracterización profunda de variantes mediante secuenciación de nueva generación (NGS) como herramienta predictiva precoz. El seguimiento de variantes minoritarias a nivel sub-consenso permite anticipar el fracaso terapéutico, facilitando la interrupción temprana de tratamientos ineficaces y la implementación de estrategias de medicina de precisión. La integración del método QFF con el análisis del genoma completo proporciona un marco sólido para comprender la persistencia viral y mejorar los resultados terapéuticos en la infección crónica por VHE. |
| Abstract: |
Hepatitis E is an inflammatory liver disease caused by the Hepatitis E Virus (HEV), a leading cause of acute viral hepatitis worldwide with an estimated 20 million annual infections. Although most infections are self-limiting, the disease can progress to a chronic state in immunocompromised individuals, such as solid organ transplant recipients, potentially leading to progressive liver fibrosis and cirrhosis. Current clinical guidelines recommend a three-month course of ribavirin (RBV) monotherapy. However, primary treatment failure and viral relapse remain significant obstacles, particularly due to the lack of approved alternative antivirals. This thesis investigates HEV as a quasispecies, a dynamic population of closely related but genetically distinct variants that exists as a "mutant cloud", mainly due to the lack of proofreading mechanisms in the viral polymerase RNA-dependent RNA polymerase. To better understand and visualize these dynamics, we have established a novel analytical approach called Quasispecies Fitness Fractions (QFF), stratifying the viral population into four categories based on haplotype frequency: master, emerging, low fitness and very low fitness. This method provides a more comprehensive visualization of the quasispecies status and evolution rather than traditional diversity metrics, which simplify complex viral structures into single numerical values. Through the QFF categorization to two HEV long-lasting chronically infected patients who failed multiple courses of RBV, we have identified a significant discrepancy between genotypic and phenotypic evolution when the virus was subjected to RBV pressure. Longitudinal analysis revealed that, while viral populations became highly unstructured at the nucleotide level (genotypic), they remained remarkably stable at the amino acid level (phenotypic), with the master phenotype accounting for 60-80% of the viral population, whereas the master genotype dropped below 10%. These findings suggest that HEV may take profit of synonymous mutations to preserve protein functionality and viral fitness, effectively using the mutagenic drug as an evolutionary catalyst rather than undergoing lethal mutagenesis or entering to "error catastrophe" characterized by loss of viral genetic information. This increased genetic heterogeneity enables the virus to adapt more rapidly to selective pressures. To complement quasispecies studies, we applied shotgun metagenomics sequencing to the samples from the patient of the first study who exhibited a profile of RBV resistance development upon a second exposure to the drug. This approach identified several resistance-associated substitutions within the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) amino acid domain located in ORF1 genomic region, including D1384N and Y1587F. Importantly, some of these mutations were detectable as minor variants at sub-consensus levels before they became dominant in the population or contributed to clinical treatment failure. The study also confirmed the increase in diversity observed in the QFF analysis, as well as the rise in the transition-to-transversion ratio (Ts/Tv), serving as a genomic signature of RBV's mutagenic impact. From a clinical perspective, our results suggest that RBV monotherapy, particularly in patients with high HEV viral loads, may drive the selection of fitness-enhancing mutations. Therefore, mutagenic therapies should ideally be combined with other antiviral inhibitors able to reduce the size of the mutant cloud and minimize the likelihood of resistance emergence. In addition, to prevent relapse, RBV should be continued for several months until serum HEV-RNA becomes undetectable tests using the most sensitive assay available, if possible. Finally, this thesis reinforces the clinical importance of deep variant profiling using Next-Generation Sequencing (NGS) as an early predictive tool. By monitoring minor variants at sub-consensus levels, clinicians can anticipate treatment failure in advance, allowing for the early discontinuation of ineffective therapies and the implementation of precision medicine strategies. The integration of the QFF method and whole genome analysis provides a robust framework for understanding viral persistence and improving therapeutic outcomes in chronic HEV infection. |
| Note: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Rights: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Language: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Subject: |
Virus de l'Hepatitis E ;
Hepatitis E Virus ;
Virus de la Hepatitis E ;
Quasiespècies ;
Quasispecies ;
Quasiespecies ;
Ribavirina ;
Ribavirin ;
Ciències de la Salut |
guest ::
