| Data: |
2026 |
| Resum: |
La SUMOilació és una modificació post-traduccionals en la qual SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) s'uneix covalentment a lisines de les proteïnes diana. Aquesta modificació reversible regula diversos processos cel·lulars, com ara la transcripció, l'estabilitat de la forquilla de replicació i la reparació d'errors a l'ADN, i es produeix a través d'una cascada enzimàtica dependent de l'ATP que implica la participació de 3 enzims: E1, E2 i E3. Nse2 és una SUMO E3 lligasa integrada dins del complex Smc5/6, membre de la família dels complexos de Manteniment Estructural dels Cromosomes (en anglès, Structural Maintenance of Chromosomes, SMC) essencial per a l'estabilitat genòmica. Col·locada a la regió arm de Smc5, Nse2 catalitza la SUMOilació de substrats associats a Smc5/6. En aquesta tesi, analitzem l'activitat de la SUMO E3 lligasa de l'Nse2 dins del complex Smc5/6, revelant diversos mecanismes reguladors de la seva activitat enzimàtica. L'activació de l'Nse2 requereix d'una interacció amb l'ADN mono cadena o l'ADN doble cadena i depèn de dos SIMs (Sumo Interacting Motifs en anglès, SIM1 i SIM2) que orienten el SUMO donor i el SUMO backside per a la catàlisi. La unió de RPA70 a l'ADN mono-cadena inhibeix l'activació en bloquejar l'accés a l'ADN. L'autoSUMOil·lació de lisines dins del coiled coil de Smc5, especialment a prop de Nse2, augmenta encara més la transferència de SUMO, mentre que les mutacions que afecten la unió o la hidròlisi d'ATP de Smc5/6 no afecten la catàlisi in vitro. Més enllà d'aquests mecanismes intrínsecs, Nse2 també és modulada pel cofactor Esc2. Els seus dominis similars a SUMO actuen com a potenciadors al·lostèrics de l'alliberament del grup SUMO des del tioèster Ubc9~SUMO mitjançant un mecanisme dependent de SIM2. Finalment, descrivim les estratègies estructurals utilitzades per analitzar tant el complex Smc5/6 del llevat com els seus subcomplexos, així com el complex humà Arm/Smc5-Nse2 conjuntament amb Nip45, mitjançant cristal·lografia de raigs X i cryo-EM. Aquests assoliments revelen la flexibilitat conformacional i la variabilitat que compliquen la determinació d'alta resolució dels (sub)complexos de Smc5/6. Per superar les limitacions importants en el comportament de les mostres en les reixes de cryo-EM convencionals, implementem la tècnica Streptavidin Affinity Grid (SAG), que millora notablement la distribució i l'estabilitat de les partícules. |
| Resum: |
La SUMOilación es una modificación post-traduccional en la cual SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) se une covalentemente a lisinas de las proteínas diana. Esta modificación reversible regula varios procesos celulares, como la transcripción, la estabilidad de horquillas de replicación y la reparación de errores en el ADN. Se produce a través de una cascada enzimática dependiente de ATP que implica la participación de tres enzimas: E1, E2 y E3. Nse2 es una SUMO E3 ligasa integrada en el complejo Smc5/6, miembro de la familia de los complejos de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas (en inglés, Structural Maintenance of Chromosomes, SMC) el cual es esencial para la estabilidad genómica. Colocada en la región arm de Smc5, Nse2 cataliza la SUMOilación de sustratos asociados a Smc5/6. En esta tesis, analizamos la actividad de la SUMO E3 ligasa de la Nse2 dentro del complejo Smc5/6, revelando varios mecanismos reguladores de su actividad enzimática. La activación de la Nse2 requiere de la interacción con ADN mono cadena o ADN doble cadena y depende de dos SIMs (Sumo Interacting Motifs, SIM1 y SIM2) que orientan el SUMO donor y el SUMO backside para la catálisis. La unión de RPA70 al ADN mono cadena inhibe la activación en bloquear el acceso al ADN. La autoSUMOilación de lisinas dentro del coiled coil de Smc5, especialmente cerda de Nse2, aumenta aún más la transferencia de SUMO, mientras que las mutaciones que afectan a la unió o la hidrólisis de ATP de Smc5/6 no afectan la catálisis in vitro. Más allá de estos mecanismos intrínsecos, Nse2 es modulada por el cofactor Esc2. Sus dominios similares a SUMO actúan como potenciadores alostéricos de la liberación del grupo SUMO des del tioéster Ubc9~SUMO mediante un mecanismo dependiente de SIM2. Finalmente, describimos las estrategias estructurales usadas para analizar tanto el complejo Smc5/6 de levadura como sus subcomplejos, así como el complejo humano Arm/Smc5-Nse2 junto a Nip45, mediante cristalografía de rayos X y cryo-EM. Estos esfuerzos desvelan la flexibilidad conformacional y la variabilidad que complican la determinación de alta resolución de los (sub)complejos de Smc5/6. Para superar las limitaciones importantes en el comportamiento de las muestras en las rejillas de cryo-EM convencionales, implementamos la técnica de Streptavidin Affinity Grid (SAG), que mejora notablemente la distribución i la estabilidad de las partículas. |
| Resum: |
SUMOylation is a post-translational modification in which the small ubiquitin-like modifier (SUMO) is covalently attached to lysine residues on target proteins. This reversible modification regulates diverse cellular processes, including transcription, replication fork stability, and DNA damage repair, and proceeds through an ATP-dependent enzymatic cascade involving E1, E2 (Ubc9), and E3 ligases. Nse2 is a SUMO E3 ligase embedded within the Smc5/6 complex, a Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) family member essential for genome stability. Positioned on the Smc5 coiled-coil arm, Nse2 catalyzes SUMOylation of substrates associated with Smc5/6. In this thesis, we dissect the SUMO E3 ligase activity of Nse2 within the full-length Smc5/6 complex, revealing several regulatory layers. Nse2 activation requires direct engagement with ssDNA or dsDNA and depends on two SUMO-interacting motifs (SIM1 and SIM2) that orient donor and backside SUMO for catalysis. RPA70 binding to ssDNA inhibits activation by blocking DNA access. AutoSUMOylation of lysine residues within the Smc5 coiled coil, especially near Nse2, further enhances SUMO transfer, whereas mutations impairing Smc5/6 ATP binding or hydrolysis do not affect catalysis in vitro. Beyond these intrinsic mechanisms, Nse2 is also modulated by the cofactor Esc2, whose SUMO-like domains act as allosteric enhancers of Ubc9~SUMO thioester discharge through a SIM2-dependent mechanism. Finally, we describe the structural strategies used to analyze both the yeast full-length Smc5/6 complex and its engineered subcomplexes, as well as the human Arm/Smc5-Nse2 complex in association with Nip45, using X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. These efforts reveal the pronounced conformational flexibility and compositional variability that complicate high-resolution determination of Smc5/6 assemblies. To overcome major limitations in sample behavior on conventional cryo-EM grids, we implemented Streptavidin Affinity Grid (SAG) technology, which markedly improved particle distribution and stability. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
SUMOilació ;
SUMOylation ;
SUMOilación ;
Complex Smc5/6 ;
Smc5/6 complex ;
Complejo Smc5/6 ;
SUMO E3 lligasa ;
SUMO E3 ligase ;
SUMO E3 ligasa ;
Ciències de la Salut |
visitant ::
identificació
