| Date: |
2026 |
| Abstract: |
Les vesícules extracel·lulars (EVs) i les partícules similars a virus (VLPs) derivades del virus de la immunodeficiència humana (HIV-1) representen plataformes prometedores per al desenvolupament de vacunes i l'administració dirigida de fàrmacs, gràcies a la seva capacitat per transportar i presentar molècules amb funcionalitat biològica. No obstant això, per transformar aquest potencial en aplicacions clíniques reals, és necessari optimitzar les estratègies de funcionalització que permeten incorporar molècules terapèutiques a la superfície o a l'interior d'aquestes partícules, així com aprofundir en la seva caracterització molecular. En aquesta tesi, s'aborden aquests reptes mitjançant l'optimització d'estratègies químiques i genètiques de funcionalització superficial, i mitjançant una caracterització multi-òmica orientada a establir un marc per a futures estratègies de càrrega selectiva, tot això, aplicat a VLPs i EVs produïdes en cèl·lules HEK293. El Bloc I, Capítols 1 i 2, es centra en la funcionalització química mitjançant química click (click chemistry), concretament mitjançant la reacció de cicloaddició azida-alquí activada per tensió (SPAAC). Al Capítol 1, aquesta reacció va ser optimitzada mitjançant l'estudi de la seva cinètica i l'aplicació de disseny d'experiments (DoE), que va permetre millorar l'eficiència de funcionalització. A més, VLPs i EVs van ser funcionalitzades amb epítops de la proteïna Spike del SARS-CoV-2, els quals van ser validats mitjançant un assaig amb sèrums de pacients amb COVID-19. Al Capítol 2, es va dur a terme una anàlisi proteòmica orientada a identificar els determinants moleculars que condicionen l'eficiència de la funcionalització mitjançant SPAAC, demostrant-se que l'eficiència no depèn de l'abundància proteica, sinó més bé de l'accessibilitat espacial dels residus aminoacídics reactius. El Bloc II, Capítols 3 i 4, aborda la funcionalització genètica i la seva aplicació en el desenvolupament de vacunes. Al Capítol 3, es va emprar la proteïna CD81 com a proteïna bastida per a l'exposició de pèptids a la superfície de VLPs i EVs, confirmant-se la seva correcta incorporació. Així mateix, es va estudiar l'efecte compensatori de les tetraspanines, permetent millorar la producció de VLPs i la funcionalització d'EVs. Al Capítol 4, l'estratègia d'exposició de pèptids va ser aplicada per generar candidats vacunals front a Mycobacterium tuberculosis utilitzant epítops derivats de la proteïna mIHF, relacionada amb la persistència bacteriana. Després de la seva avaluació in vivo en un model murí, alguns candidats basats en VLPs van demostrar induir una resposta humoral específica, reduir la càrrega bacteriana i limitar el dany pulmonar en animals mascles, evidenciant el seu potencial com a plataforma vacunal contra la tuberculosi. El Bloc III, Capítol 5, es centra en la caracterització transcriptòmica i lipidòmica de VLPs i EVs. Aquest estudi va permetre revelar diferències amb implicacions directes a nivell de seguretat, funcionalitat i disseny racional. Es van identificar motius específics en els ARNm diferencialment expressats, així com microARNs sobreexpressats amb funcions oncogèniques i supressores de tumors. A més, les VLPs van mostrar un enriquiment en ARNm adenoviral procedent del genoma de les cèl·lules HEK293. A nivell lipídic, les VLPs van mostrar un menor contingut de lípids, però enriquit en espècies associades amb una major estabilitat i rigidesa de la membrana. En conjunt, aquesta tesi proporciona estratègies químiques i genètiques optimitzades per a la funcionalització de VLPs i EVs, juntament amb una caracterització molecular essencial per al disseny racional de futures estratègies de funcionalització. En general, aquest treball contribueix a l'avanç de VLPs i EVs com a plataformes per al desenvolupament de vacunes i l'administració dirigida de fàrmacs. |
| Abstract: |
Las vesículas extracelulares (EVs) y las partículas similares a virus (VLPs) derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) representan plataformas prometedoras para el desarrollo de vacunas y la administración dirigida de fármacos, debido a su capacidad para transportar y presentar moléculas con funcionalidad biológica. Sin embargo, para transformar este potencial en aplicaciones clínicas reales, es necesario optimizar las estrategias de funcionalización que permiten incorporar moléculas terapéuticas en la superficie o el interior de estas partículas, así como profundizar en su caracterización molecular. En esta tesis, se abordan estos desafíos mediante la optimización de estrategias químicas y de ingeniería genética de funcionalización superficial, y mediante una caracterización multi-ómica orientada a establecer un marco para futuras estrategias de carga selectiva, todo ello, aplicado a VLPs y EVs producidas en células HEK293. El Bloque I, Capítulos 1 y 2, se centra en la funcionalización química mediante química click (click chemistry), concretamente mediante la reacción de cicloadición azida-alquino promovida por tensión (SPAAC). En el Capítulo 1, esta reacción fue optimizada mediante el estudio de su cinética y la aplicación de diseño de experimentos (DoE), lo que permitió mejorar la eficiencia de funcionalización. Además, VLPs y EVs fueron funcionalizadas con epítopos de la proteína Spike del SARS-CoV-2, los cuales fueron validados mediante un ensayo con sueros de pacientes de COVID-19. En el Capítulo 2, se llevó a cabo un análisis proteómico orientado a identificar los determinantes moleculares que condicionan la eficiencia de la funcionalización mediante SPAAC, demostrándose que la eficiencia no depende de la abundancia proteica, sino más bien de la accesibilidad espacial de los residuos aminoacídicos reactivos. El Bloque II, Capítulos 3 y 4, aborda la funcionalización genética y su aplicación en el desarrollo de vacunas. En el Capítulo 3, se empleó la proteína CD81 como proteína andamio para la exposición de péptidos en la superficie de VLPs y EVs, confirmándose su correcta incorporación. Asimismo, se estudió el efecto compensatorio de las tetraspaninas, permitiendo mejorar la producción de VLPs y la funcionalización de EVs. En el Capítulo 4, la estrategia de exposición de péptidos fue aplicada para generar candidatos vacunales frente a Mycobacterium tuberculosis utilizando epítopos derivados de la proteína mIHF, relacionada con la persistencia bacteriana. Tras su evaluación in vivo en un modelo murino, algunos candidatos basados en VLPs demostraron inducir una respuesta humoral específica, reducir la carga bacteriana y limitar el daño pulmonar en animales machos, evidenciando su potencial como plataforma vacunal contra la tuberculosis. En el Bloque III, Capítulo 5, se centra en la caracterización transcriptómica y lipidómica de VLPs y EVs. Este estudio permitió revelar diferencias con implicaciones directas a nivel de seguridad, funcionalidad y diseño racional. Se identificaron motivos específicos en los ARNm diferencialmente expresados, así como microARNs sobreexpresados con funciones oncogénicas y supresoras de tumores. Además, las VLPs mostraron un enriquecimiento en ARNm adenoviral procedente del genoma de las células HEK293. A nivel lipídico, las VLPs mostraron un menor contenido de lípidos, pero enriquecido en especies asociadas con una mayor estabilidad y rigidez de la membrana. En conjunto, esta tesis proporciona estrategias químicas y genéticas optimizadas para la funcionalización de VLPs y EVs, junto con una caracterización molecular esencial para el diseño racional de futuras estrategias de funcionalización. En general, este trabajo contribuye al avance de VLPs y EVs como plataformas para el desarrollo de vacunas y la administración dirigida de fármacos. |
| Abstract: |
Extracellular vesicles (EVs) and virus-like particles (VLPs) derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) represent promising platforms for vaccine development and drug delivery, due to their ability to transport and present biologically functional molecules. However, to translate their potential into real clinical applications, it is necessary to optimize functionalization strategies that allow the incorporation of therapeutic molecules on the surface or inside these particles, as well as to deepen in their molecular characterization. In this thesis, these challenges are addressed through the optimization of chemical and genetic engineering strategies for surface functionalization, and through a multi-omic characterization aimed at establishing a framework for future selective loading strategies, all applied to VLPs and EVs produced in HEK293 cells. Part I, Chapters 1 and 2, focuses on chemical functionalization through click chemistry, specifically using the strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) reaction. In Chapter 1, this reaction was optimized through the study of its kinetics and the application of Design of Experiments (DoE), which enabled an improvement in functionalization efficiency. Moreover, VLPs and EVs were functionalized with epitopes derived from the SARS-CoV-2 Spike protein, which were validated through an immunoassay using sera from COVID-19 patients. In Chapter 2, a proteomic analysis was performed to identify the molecular determinants that influence SPAAC functionalization efficiency, demonstrating that the efficiency does not depend on protein abundance but rather on the spatial accessibility of reactive amino acid residues. Part II, Chapters 3 and 4, addresses genetic functionalization and its application in vaccine development. In Chapter 3, the CD81 protein was used as a scaffold protein for the display of peptides on the surface of VLPs and EVs, confirming its correct incorporation. The compensation effect of tetraspanins was also investigated, allowing enhancement of VLP production and EV functionalization. In Chapter 4, the peptide display strategy was applied to generate vaccine candidates against Mycobacterium tuberculosis using epitopes derived from the mIHF protein, associated with bacterial persistence. Following in vivo evaluation in a murine model, some VLP-based vaccine candidates induced a specific humoral response, reduced bacterial load, and limited lung damage in male animals, demonstrating their potential as a tuberculosis vaccine platform. Part III, Chapter 5, focuses on the transcriptomic and lipidomic characterization of VLPs and EVs. This study revealed differences with direct implications for safety, functionality, and rational design. Specific motifs were identified in differentially expressed mRNAs, as well as overexpressed microRNAs with oncogenic and tumor-suppressor functions. Furthermore, VLPs showed enrichment in adenoviral mRNAs derived from the HEK293 genome. At the lipid level, VLPs exhibited a lower total lipid content but were enriched in species associated with increased membrane stability and rigidity. Overall, this thesis provides optimized chemical and genetic strategies for the functionalization of VLPs and EVs, along with essential molecular characterization for the rational design of future functionalization strategies. In general, this work contributes to the advancement of VLPs and EVs as platforms for vaccine development and drug delivery. |
| Note: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biotecnologia |
| Rights: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, i la comunicació pública de l'obra, sempre que no sigui amb finalitats comercials, i sempre que es reconegui l'autoria de l'obra original. No es permet la creació d'obres derivades.  |
| Language: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Subject: |
Partícules similars a virus ;
Virus-like particles ;
Partículas similares a virus ;
Vacunes ;
Vaccines ;
Vacunas ;
Vesícules extracel·lulars ;
Extracellular vesicles ;
Vesículas extracelulares ;
Ciències Experimentals |
guest ::
