| Data: |
2026 |
| Resum: |
Les ribonucleases humanes ja no es consideren únicament enzims de manteniment per a la degradació de l'ARN. Els membres de la superfamília RNasa A participen en la defensa de l'hoste, la regulació immunitària i el processament de l'ARN extracel·lular. Entre ells, la neurotoxina derivada d'eosinòfils, també coneguda com a EDN o RNasa 2, és una ribonucleasa humana secretada associada a les respostes antivirals, l'activació dels eosinòfils i els processos inflamatoris. Atès que les seves funcions biològiques depenen tant de l'activitat catalítica com de les interaccions mediades per la superfície, comprendre com l'EDN reconeix els substrats d'ARN i els lligands és important per a una futura modulació basada en l'estructura. Aquesta tesi va investigar en primer lloc la base molecular de l'escissió d'ARNt mediada per l'EDN. Utilitzant ARNt sintètics representatius, variants d'ARNt amb una sola mutació i substrats en forquilla d'ADN/ARN, vam confirmar que l'EDN genera selectivament fragments derivats d'ARNt. Els resultats van mostrar que l'EDN escindeix preferentment els llocs que contenen uracil o citosina a la posició B1 i adenina a la posició B2. La modelització molecular va suggerir, a més, que la regió α1, els loops 3 i 4 i el strand β6 contribueixen al posicionament del substrat al voltant de les regions P−1 a P2, fet que dona suport a un mecanisme d'escissió de l'ARN específic en lloc d'inespecífic. La segona part d'aquesta tesi va explorar el reconeixement de lligands a la superfície de l'EDN. Tot i que no es va obtenir un complex cristal·lí estable unit a ARN, les estructures d'alta resolució van revelar llocs d'unió conservats per a anions de tipus carboxilat. Basant-se en la coneguda interacció de les RNases d'eosinòfils amb els glicosaminoglicans, els cristalls d'EDN es van sotmetre a més a impregnació amb diversos mono- i disacàrids. Aquests experiments van identificar múltiples regions d'unió a sucres al llarg de la superfície de la proteïna, incloent-hi llocs per a sucres comuns, sucres N-acetilats i àcid siàlic. Aquests resultats suggereixen que l'EDN combina l'activitat ribonucleolítica amb propietats de reconeixement de superfície de tipus lectina. Finalment, aquesta tesi va emprar el cribatge de fragments mitjançant cristal·lografia de raigs X per mapar els llocs d'unió de molècules petites a l'EDN/RNasa 2. El screening de 1. 000 fragments tipus Rule-of-Three (Ro3) va produir 949 conjunts de dades de difracció d'alta qualitat i va identificar 69 hits confirmats distribuïts en cinc regions d'unió diferents, dels quals 26 van mostrar interaccions d'unió específiques. Entre aquestes regions, els lligands L4 i L5 presenten butxaques d'unió ben definides amb una única interfície de contacte, situades de manera adjacent als llocs catalítics d'escissió i setis d'unió principals (P1, B1 i B2). La regió L2 es localitza proper a la cadena principal del residu K38 de la tríada catalítica. En canvi, les regions L1 i L3 van allotjar el nombre més gran de hits; amb preferències específiques d'unió i situades al costat oposat del domini catalític. Els resultats obtinguts són d'interès pel disseny d'una nova generación de candidats de molècules moduladores de les activitats biològiques de l'EDN, i en particular inhibidors de la seva potencial acció pro-inflammatòria. |
| Resum: |
Las ribonucleasas humanas ya no se consideran únicamente enzimas de mantenimiento implicadas en la degradación del ARN. Los miembros de la superfamilia RNasa A participan en la defensa del huésped, la regulación inmunitaria y el procesamiento del ARN extracelular. Entre ellos, la neurotoxina derivada de eosinófilos, también conocida como EDN o RNasa 2, es una ribonucleasa humana secretada asociada a las respuestas antivirales, la activación de los eosinófilos y los procesos inflamatorios. Dado que sus funciones biológicas dependen tanto de la actividad catalítica como de las interacciones mediadas por la superficie, comprender cómo la EDN reconoce los sustratos de ARN y los ligandos es importante para una futura modulación basada en la estructura. Esta tesis investigó en primer lugar la base molecular de la escisión de ARNt mediada por la EDN. Utilizando ARNt sintéticos representativos, variantes de ARNt con una única mutación y sustratos de horquilla de ADN/ARN, confirmamos que la EDN genera selectivamente fragmentos derivados de ARNt. Los resultados mostraron que la EDN escinde preferentemente los sitios que contienen uracilo o citosina en la posición B1 y adenina en la posición B2. La modelización molecular sugirió, además, que la región α1, los bucles 3 y 4 y la hebra β6 contribuyen al posicionamiento del sustrato alrededor de las regiones P−1 a P2, lo que apoya un mecanismo de escisión del ARN específico en lugar de inespecífico. La segunda parte de esta tesis exploró el reconocimiento de ligandos en la superficie de la EDN. Aunque no se obtuvo un complejo cristalino estable unido a ARN, las estructuras de alta resolución revelaron sitios de unión conservados para aniones de tipo carboxilato. Basándose en la conocida interacción de las RNasas de eosinófilos con los glicosaminoglicanos, los cristales de EDN se sometieron además a impregnación con varios mono- y disacáridos. Estos experimentos identificaron múltiples regiones de unión a azúcares a lo largo de la superficie de la proteína, incluyendo sitios para azúcares comunes, azúcares N-acetilados y ácido siálico. Estos resultados sugieren que la EDN combina la actividad ribonucleolítica con propiedades de reconocimiento de superficie de tipo lectina. Finalmente, esta tesis empleó el cribado de fragmentos mediante cristalografía de rayos X para mapear los sitios de unión de moléculas pequeñas a la EDN/RNasa 2. El cribado de 1. 000 fragmentos de tipo Rule-of-Three (Ro3) produjo 949 conjuntos de datos de difracción de alta calidad e identificó 69 hits confirmados distribuidos en cinco regiones de unión diferentes, de los cuales 26 mostraron interacciones de unión específicas. Entre estas regiones, L4 y L5 presentan bolsillos de unión bien definidos con una única interfaz de contacto, situados de manera adyacente a los sitios catalíticos de escisión y a los principales sitios de unión (P1, B1 y B2). La región L2 se localiza próxima a la cadena principal del residuo K38 de la tríada catalítica. En cambio, las regiones L1 y L3 alojaron el mayor número de hits, con preferencias específicas de unión y situadas en el lado opuesto del dominio catalítico. Los resultados obtenidos son de interés para el diseño de una nueva generación de moléculas candidatas moduladoras de las actividades biológicas de la EDN y, en particular, de inhibidores de su potencial acción proinflamatoria. |
| Resum: |
Human ribonucleases are no longer viewed only as housekeeping enzymes for RNA degradation. Members of the RNase A superfamily participate in host defence, immune regulation and extracellular RNA processing. Among them, eosinophil-derived neurotoxin, also known as EDN or RNase 2, is a secreted human ribonuclease associated with antiviral responses, eosinophil activation and inflammatory processes. Since its biological functions depend on both catalytic activity and surface-mediated interactions, understanding how EDN recognizes RNA substrates and ligands is important for future structure-based modulation. This thesis first investigated the molecular basis of EDN-mediated tRNA cleavage. Using representative synthetic tRNAs, single-mutant tRNA variants and DNA/RNA hairpin substrates, we confirmed that EDN selectively generates tRNA-derived fragments. The results showed that EDN preferentially cleaves sites containing uracil or cytosine at the B1 position and adenine at the B2 position. Molecular modelling further suggested that the α1 region, loops 3 and 4, and the β6 strand contribute to substrate positioning around the P−1 to P2 regions, supporting a specific rather than nonspecific RNA cleavage mechanism. The second part of this thesis explored ligand recognition on the EDN surface. Although a stable RNA-bound crystal complex was not obtained, high-resolution structures revealed conserved binding sites for carboxylate anions. Based on the known interaction of eosinophil RNases with glycosaminoglycans, EDN crystals were further soaked with several mono- and disaccharides. These experiments identified multiple sugar-binding regions across the protein surface, including sites for common sugars, N-acetylated sugars and sialic acid. These findings suggest that EDN combines ribonucleolytic activity with lectin-like surface-recognition properties. Finally, this thesis used X-ray crystallographic fragment screening to map small-molecule binding sites on EDN/RNase2. Screening of 1,000 Rule-of-Three (Ro3) fragments yielded 949 high-quality diffraction datasets and identified 69 confirmed fragment hits distributed across five distinct binding regions, 26 of which exhibited specific binding interactions. Among these regions, L4 and L5 feature well-defined binding pockets with a single contact interface, situated adjacent to the critical catalytic cleavage sites (P1, B1, and B2). The L2 region is located in close proximity to the backbone of the catalytic triad residue K38. Conversely, regions L1 and L3 accommodated the highest number of fragment hits; these two pockets demonstrate specific fragment-binding preferences and are positioned on the opposite side of the catalytic domain. Results can be applied to design a novel generation of candidates for the modulation of EDN properties, such as inhibitors of the protein pro-inflammatory activity. |
| Nota: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
EDN/RNasa 2 ;
Cristal·lografia de raigs X ;
X-ray crystallography ;
Cristalografía de rayos X ;
Escissió de tRNA ;
TRNA cleavage ;
Escisión de tRNA ;
Ciències Experimentals |
visitant ::
identificació
dir.
