Estudio de la producción heteróloga de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae en la levadura metilotrófica Pichia pastoris
Serrano González, Alicia
Valero Barranco, Francisco, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Ferrer, Pau, dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental)
Publicación: |
Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2004 |
Resumen: |
El trabajo recoge los principales aspectos de la producción recombinante de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura Pichia pastoris. El sistema de expresión empleado está basado en la utilización del promotor de la alcohol oxidasa (PAOX1) de la levadura y, por lo tanto es dependiente de la utilización de metanol como substrato inductor. El trabajo recoge una serie de estudios de producción en bioreactor, operando en fed-batch, en los que la productividad del sistema se incrementa hasta en un factor de 11, mediante el estudio de la estrategia de adición del metanol a lo largo de la etapa de producción. Asimismo, estos cultivos se han realizado utilizando un medio de composición sintética, mucho mas económico que el complejo. La optimización de la producción también se ha abordado mediante la construcción de cepas multicopia para el gen ROL, estudiando igualmente, el efecto de la expresión recombinante de la lipasa sobre la cepa hospedadota. Por otro lado, se han construido vectores de expresión basados en la utilización de promotores independientes de la utilización del metanol. Se han obtenido cepas de P. pastoris que expresan la ROL de forma constitutiva y mediante inducción por fuente de nitrógeno. El trabajo recoge en último lugar un protocolo para la recuperación de la ROL recombinante desde el caldo de cultivo hasta la obtención de un extracto liofilizado de lipasa ROL. La purificación de la lipasa se ha llevado a acabo a través de la combinación de los pasos de cromatografía, de intercambio catiónico e interacción hidrofóbica. El grado de pureza obtenido es el adecuado para la utilización de la enzima como biocatalizador en reacciones de química fina y para la obtención de anticuerpos contra la misma. |
Resumen: |
This work summarises the main aspects of the recombinant production of a lipase of the fungi Rhizopus oryzae (ROL) expressed in the yeast Pichia pastoris. The expression system used is based on the utilization of the alcohol oxidase promoter (PAOX1) of the yeast and therefore is dependent on methanol as the inductor substrate. The productivity of this system has been increased by a factor of 11 by studying the methanol feeding strategy during fed-batch fermentations in bioreactors. Moreover, a synthetic cultivation media has been used for these experiments, which is much more inexpensive than the regular complex ones. Furthermore, ROL multicopy strains have been also developed in order to optimise the final lipase production of the system. In addition, the study of the ROL production has been carried out based on the development of different expression vectors independent of the use of methanol as an inductor of the expression. In this context, we have developed new recombinant P. pastoris strains for the constitutive and nitrogen-dependent expression of ROL. Finally, a down-stream process for the recovery of the lipolitic enzyme has been defined through all stages: from the broth media to the final lyophilised product. The ROL purification has been achieved through two single-chromatography steps, which are cationic exchange and hydrophobic interaction. The final product has a purity which is appropriate for its use in fine chemical reactions and the development of antibodies against it. |
Nota: |
Consultable des del TDX |
Nota: |
Títol obtingut de la portada digitalitzada |
Nota: |
Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Escola Tècnica Superior d'Enginyeria, Departament d'Enginyeria Química, 2002 |
Nota: |
Bibliografia |
Derechos: |
ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Lengua: |
Català |
Documento: |
Tesi doctoral |
Materia: |
Llevats ;
Biotecnologia ;
Proteïnes recombinants ;
Lipasa |
ISBN: |
8468860751 |
Adreça alternativa:: https://hdl.handle.net/10803/3171
El registro aparece en las colecciones:
Documentos de investigación >
Tesis doctorales
Registro creado el 2009-05-07, última modificación el 2022-05-08