dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
| Publicació: |
Bellaterra : Universitat Autònoma de Barcelona, 2004 |
| Resum: |
Esta tesis está estructurada en forma de dos publicaciones. En la primera de ellas se utiliza una cepa de Saccharomyces cerevisiae que presenta un fenotipo sintético letal condicional que consiste en una parada del ciclo celular en la fase G1 con el fin de identificar genes que en multicopia revierten este fenotipo. La cepa en cuestión presenta una delección del gen que codifica la fosfatasa Sit4 y una sobreactivación de la fosfatasa Ppz1, que se consigue mediante la represión controlable de un inhibidor endógeno (Hal3). Utilizando esta aproximación se identificó el gen NHA1, que codifica un antiportador Na+,K+/H+ implicado en la detoxificación de cationes sodio y litio. Como consecuencia, se estudió si otros genes con función similar podían revertir el fenotipo sintético letal. En este sentido el trabajo demuestra que ni la potente Na+-ATPasa Ena1 de S. cerevisiae ni el antiportador Sod2 de Schizosaccharomyces pombe son capaces de mimetizar la funcionalidad de Nha1 en este sentido. En este trabajo también se demuestra que en la región carboxi terminal de la proteína existen elementos imprescindibles para la función de Nha1 como regulador del ciclo celular y residuos importantes para el transporte de cationes potasio. No obstante, el hecho de que la proteína Cnh1 de Candida albicans, con una función similar a Nha1 sea incapaz de revertir el bloqueo de crecimiento de la cepa modelo, parece indicar que una la capacidad de transporte de potasio de Nha1 no es la responsable de la superación de esta parada del ciclo celular. Asimismo, el hecho de que versiones mutadas de Nha1 deficientes en el transporte de sodio y litio sean capaces de revertir el fenotipo de letalidad sintética y de que mutantes funcionales para el transporte estos cationes y de cationes potasio no lo sean, descarta una relación entre el transporte de cationes y el efecto de Nha1 en el ciclo celular. Otro resultado importante en este trabajo ha sido la identificación de mutaciones que permiten la discriminación entre cationes sodio y potasio en este tipo de antiportadores. En el segundo trabajo publicado se hace un estudio detallado de la región carboxi-terminal de Nha1 necesaria para su función en el ciclo celular que fue identificada en la publicación anterior. Este análisis se ha realizado mediante la generación de mutaciones al azar en la zona en cuestión por la técnica de Random Mutagenesis PCR. Como resultado, se han identificado una serie de residuos necesarios para la función en el ciclo celular y se ha analizado la funcionalidad de las versiones mutadas resultantes como detoxificadores de sodio, litio y potasio, identificando residuos y zonas importantes para la actividad como detoxificador de sodio y litio por un lado y de potasio por el otro. |
| Resum: |
This work is organized as a compound of two publications. On the first one, a Saccharomyces cerevisiae strain that shows a conditional synthetic lethal phenotype is used for identifying genes that, in multicopy, are capable of suppress this phenotype. This lethality consists in a G1 blockage of the cell cycle. In this strain, the gene that codifies the Sit4 phosphatase is delectioned and the Ppz1 phosphatase is overactivated by the regulatable repression on an endogenous inhibitor (Hal3). By using this approach, the NHA1 gene was identified. This gene codifies an Na+,K+/H+ antiporter that is associated to the detoxifycation of toxic cations, as lithium and sodium. As a consequence, we analyzed if other genes with similar function were able to suppress the synthetic lethal phenotype. This work demonstrates that neither the powerful Na+-ATPase Ena1 from S. cerevisiae nor the sodium antiporter Sod2 from Schizosaccharomyces pombe were capable of mimicking the function of Nha1 in this subject. This work also evidences that on the carboxyl-terminal region of the protein, there are elements that are essential for the function of Nha1 as a cell cycle regulator and residues that are important for the potassium cations transport. Nevertheless, the fact that the protein from Candida albicans Cnh1, that has a similar function to Nha1, was not able to suppress the cell cycle blockage of the model strain seems to indicate that the potassium transport capacity of Nha1 is not the responsible of the overcome of this blockage. Likewise, the fact that some mutated versions of Nha1 those are deficient on sodium and lithium transport were able to suppress the synthetic lethal phenotype and that some mutants that are functional as transporters of those and potassium cations were not able to, discards any relation between the cation detoxifycation and the effect of Nha1 on the cell cycle. Another important result of this work was the identification of mutations that permit the discrimination of sodium and potassium cations on this kind of transporters. On the second publication, a detailed study of the carboxyl-terminal region essential for the Nha1 function on the cell cycle described in the first paper is showed. This analysis was done by the generation of random mutations on this region (by Random Mutagenesis PCR). As a result of this approach, a series of residues those are essential for the cell cycle function were identified. The resultant mutated versions of Nha1 were analyzed by their capacity of sodium, lithium and potassium detoxifycation, identifying some residues that are important for the activity of the antiporter as sodium and lithium transporter in one hand and as transporter of potassium on the other. |
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Consultable des del TDX |
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Títol obtingut de la portada digitalitzada |
| Nota: |
Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona, Facultat de Ciències, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, 2003 |
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Bibliografia |
| Drets: |
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| Llengua: |
Castellà |
| Document: |
Tesi doctoral |
| Matèria: |
Cicle de la cèl·lula ;
Llevat de cervesa ;
Aspectes genètics |
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dir. (Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular)
