| Publicació: |
[Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2020. |
| Descripció: |
1 recurs en línia (284 pàgines) |
| Resum: |
Les virus-like particles (VLPs) han sorgit com a una alternativa a les vacunes convencionals basades en virus atenuats o inactivats. La seva capacitat d'autoacoblament en base a l'expressió d'una proteïna matriu i l'absència de material genòmic d'origen víric les fa candidats atractius per a una multitud d'aplicacions. Les VLPs de Gag del virus de la immunodeficiència humana (VIH) són un tipus de VLPs amb envolta que han atret especial interès degut a les seves propietats estructurals, amb aplicacions en teràpia gènica, nanotecnologia i el desenvolupament de vacunes multivalents. Les línies cel·lulars d'insecte són un sistema de referència per a produir aquest tipus de nanopartícules ja que proporcionen les condicions adients per la seva producció i assemblatge. En aquesta tesi s'ha avaluat la producció de VLPs del VIH-1 en les línies d'insecte Sf9 i High Five amb el sistema d'expressió baculovirus i transfecció transitòria. Per tal d'assolir aquest objectiu, s'ha emprat una aproximació basada en l'ús combinat de metodologies de disseny d'experiments i funcions de resposta combinada. Paral·lelament, s'han incorporat una sèrie de tècniques de mesura per tal de monitoritzar i quantificar el procés productiu i per a la caracterització final de les VLPs. En el primer capítol s'analitzen les característiques d'ambdues línies cel·lulars d'insecte com a plataformes per a la producció de VLPs de GageGFP amb el sistema d'expressió baculovirus. En tots dos casos, l'observació de les VLPs per microscòpia electrònica de criogènia permet determinar que tenen una mida similar i també permet detectar la presència d'altres poblacions de nanopartícules. L'anàlisi dels nivells de producció de baculovirus resulta en un increment de 23 vegades de virus infectius en les cèl·lules Sf9 mentre que una proporció més gran de virus d'oclusió s'observa en les cèl·lules High Five. La presència d'aquest últim fenotip de baculovirus evidencia un canvi en la complexitat de la línia cel·lular High Five després de la infecció amb el baculovirus. Finalment, la combinació de les tècniques d'ultracentrifugació i virometria de flux mostra que les VLPs derivades de High Five tenen un major coeficient de sedimentació, la qual cosa indica que aquestes VLPs poden estar associades amb altres elements cel·lulars. Al segon capítol es determinen les condicions òptimes per a la producció de VLPs en les cèl·lules Sf9 i High Five amb el sistema d'expressió baculovirus. En aquest sentit, s'apliquen metodologies de disseny d'experiments i funcions d'optimització amb tècniques de quantificació directa de nanopartícules per tal d'aprofundir en aquests sistemes. Inicialment s'aborden dues situacions objectiu, la primera cercant la maximització de la concentració de VLPs (Quantitat) i la segona buscant un balanç entre producció i percentatge de VLPs amb estructura completa (Qualitat). Los niveles de producción final de VLPs en la condición de calidad son 4. 5 veces más elevados para las células Sf9 mientras que en la condición de cantidad se obtienen concentraciones de VLPs similares para ambas líneas. Al tercer capítol de la tesi es desenvolupa una estratègia de producció lliure de baculovirus i basada en la transfecció transitòria de ADN plasmídic amb polietilenimina (PEI). Anàlogament al capítol 2, s'implementa una aproximació sistemàtica de disseny d'experiments i funcions d'optimització. En ambdós casos, el recanvi de medi abans de la transfecció resulta ser beneficiós per tal d'assolir els nivells més alts d'expressió. Les condicions òptimes de concentració de cèl·lules viables, ADN i PEI es determinen en aquest estudi i la formació correcta de les VLPs produïdes es corrobora per microscòpia electrònica de criogènia. En aquest cas, les cèl·lules Sf9 assoleixen un increment de 8. 4 vegades en la producció de VLPs respecte a la línia cel·lular High Five. A l'últim capítol de la tesi es desenvolupen conjunts de cèl·lules Sf9 i High Five amb expressió estable i contínua de VLPs al llarg del temps. Aquests conjunts de cèl·lules d'expressió estable es generen a partir de la integració aleatòria d'ADN codificant al genoma de les cèl·lules, i les que són més productives se seleccionen per citometria en base a la seva fluorescència. En relació a la producció de VLPs, s'aconsegueix un increment de 3. 7 vegades en les cèl·lules High Five respecte les Sf9. Finalment, l'estabilitat d'aquests grups cel·lulars d'expressió estable es corrobora al llarg d'un mes en cultiu. |
| Resum: |
Las virus-like particles (VLPs) han surgido como a una alternativa a las vacunes convencionales basadas en virus atenuados o inactivados. Su capacidad de autoensamblaje en base a la expresión de una proteína matriz y la ausencia de material genómico de origen vírico las hace candidatos atractivos para una multitud de aplicaciones. Las VLPs de Gag del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son un tipo de VLPs con envuelta que ha suscitado especial interés debido a sus propiedades estructurales, con aplicaciones en terapia génica, nanotecnologia y el desarrollo de vacunas multivalentes. Las líneas celulares de insecto son un sistema de referencia para producir este tipo de nanopartículas puesto que proporcionan les condiciones adecuadas para su producción y ensamblaje. En esta tesis se ha evaluado la producción de VLPs del VIH-1 en las líneas de insecto Sf9 y High Five con el sistema de expresión baculovirus y transfección transitoria. Para conseguir este objetivo, se ha utilizado una aproximación basada en el uso combinado de metodologías de diseño de experimentos y funciones de respuesta combinada. Paralelamente, se han incorporado una serie de técnicas de medición para monitorizar y cuantificar el proceso productivo y para la caracterización final de las VLPs. En el primer capítulo se analizan las características de ambas líneas celulares de insecto como plataformas para la producción de VLPs de GageGFP con el sistema de expresión baculovirus. En ambos casos, la observación de las VLPs mediante microscopia electrónica de criogenia permite determinar que tienen un tamaño similar y también permite detectar la presencia de otras poblaciones de nanopartículas. El análisis de los niveles de producción de baculovirus resulta en un incremento de 23 veces de virus infectivos en las células Sf9 mientras que una proporción más gran de virus de oclusión se observa en las células High Five. La presencia de este último fenotipo de baculovirus evidencia un cambio en la complejidad de la línea celular High Five después de la infección con el baculovirus. Finalmente, la combinación de les técnicas de ultracentrifugación y virometría de flujo muestran que las VLPs derivadas de High Five tienen un mayor coeficiente de sedimentación, lo que indica que éstas pueden estar asociadas con otros elementos celulares. En el segundo capítulo se determinan las condiciones óptimas para la producción de VLPs en las células Sf9 y High Five con el sistema de expresión baculovirus. En este sentido, se aplican metodologías de diseño de experimentos y funciones de optimización con técnicas de cuantificación directa de nanopartículas para profundizar en estos sistemas. Inicialmente se consideran dos situaciones objetivo, la primera investiga la maximización de la concentración de VLPs (Cantidad) y la segunda busca un balance entre producción y porcentaje de VLPs ensambladas (Calidad). Los niveles de producción final de VLPs en la condición de calidad son 4. 5 veces más elevados para las células Sf9 mientras que en la condición de cantidad se obtienen concentraciones de VLPs similares para ambas líneas. En el tercer capítulo de la tesis se desarrolla una estrategia de producción libre de baculovirus y basada en la transfección transitoria de ADN plasmídico con polietilenimina (PEI). Análogamente al capítulo 2, se implementa una aproximación sistemática de diseño de experimentos y funciones de optimización. En ambos casos, el recambio de medio previo a la transfección resulta ser beneficioso para conseguir los niveles más altos de expresión. Las condiciones óptimas de concentración de células viables, ADN y PEI se determinan en este estudio y la formación correcta de las VLPs producidas se corrobora por microscopia electrónica de criogenia. En este caso, las células Sf9 consiguen un incremento de 8. 4 veces en la producción de VLPs respecto a la línea celular High Five. En el último capítulo de la tesis se desarrollan grupos de células Sf9 y High Five con expresión estable y continua de VLPs a lo largo del tiempo. Estos conjuntos celulares de expresión estable se generan a partir de la integración aleatoria de ADN codificante en el genoma de las células, y las que son más productivas se seleccionan por citometría en base a su fluorescencia. En cuanto a la producción de VLPs, se consigue un incremento de 3. 7 veces en las células High Five respecto a las Sf9. Finalmente, la estabilidad de estos grupos celulares de expresión estable se corrobora a lo largo de un mes en cultivo. |
| Resum: |
Virus-like particles (VLPs) have emerged as an interesting alternative to conventional vaccines based on live-attenuated or inactivated viruses. Their capacity for self-assembling upon expression of the core protein and the lack of viral genomic material make them excellent candidates for a variety of purposes. Gag VLPs from the human immunodeficiency virus (HIV) are a type of enveloped VLPs that have drawn special attention due to their structural properties with applications in gene therapy, nanobiotechnology and multivalent vaccine development. Insect cell lines are a reference system to produce these types of nanoparticles since they provide the ideal conditions for their production and assembly. In this work, the production of HIV-1 GageGFP VLPs is assessed in Sf9 and High Five insect cells with the baculovirus expression vector system (BEVS) and transient gene expression (TGE). A rational approach based on the combination of Design of Experiments (DoE) and desirability functions is used to optimize the VLP production conditions. Advanced measurement techniques are implemented to monitor and quantify the production process and for final VLP characterization. In the first chapter, the characteristics of both insect cell lines as platforms for GageGFP VLP production with the BEVS are analyzed. In both cases, similar VLP sizes for both cells are measured by cryogenic electron microscopy (cryo-EM) and other nanoparticle populations are identified. The analysis of baculovirus production levels results in a 23-fold increase of budded virus in Sf9 cells while a larger amount of occlusion-derived virus is detected in High Five cells. The presence of this baculovirus phenotype evidences a shift in the cellular complexity of High Five cells upon baculovirus infection. Finally, the combination of analytical ultracentrifugation with flow virometry reveals a higher sedimentation coefficient for High Five-derived VLPs, indicating their possible association with other cellular compounds. In the second chapter, the optimal conditions for VLP production in Sf9 and High Five cells with the BEVS are determined by means of DoE and desirability functions. Different methodologies based on direct nanoparticle quantification are used to gain insight into these systems. Two objective situations are defined, one targeting the maximization of the VLP titer (Quantity) and the second one aiming to find a balance between production and assembled VLPs (Quality). Final VLP production levels in the quality condition are 4. 5-fold higher for Sf9 cells while similar VLP concentrations are found for both insect cells in the quantity condition. In the third chapter of this thesis, a baculovirus-free VLP production strategy is optimized for both insect cells based on plasmid-mediated TGE with polyethylenimine (PEI). As in chapter 2, a systematic approach combining DoE and desirability functions is implemented. In both cases, medium exchange before transfection proves to be beneficial to achieve the highest transgene expression yields. Then, the optimal conditions for viable cell concentration at transfection, DNA and PEI concentrations are determined and the correct formation of the VLPs produced is corroborated using cryo-EM. In this case, Sf9 cells achieve a 8. 4-fold increase in VLP production compared to High Five cells. In the last chapter, stable Sf9 and High Five cell pools to produce VLPs are developed by random integration and selection of the high producer cells using fluorescence-activated cell sorting. In terms of VLP production, a 3. 7-fold increase in VLP titer is achieved in High Five over Sf9 stable pools. Finally, cell pool stability is successfully corroborated during the course of a month. |
| Nota: |
Departament responsable de la tesi: Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental. |
| Nota: |
Tesi. Doctorat. Universitat Autònoma de Barcelona. 2019. |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, i la comunicació pública de l'obra, sempre que no sigui amb finalitats comercials, i sempre que es reconegui l'autoria de l'obra original. No es permet la creació d'obres derivades.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Versió publicada |
| Matèria: |
VIH (Virus) ;
Transfecció ;
Vacunes producció |
| ISBN: |
9788449089992 |
visitant ::
identificació
