| Data: |
2025 |
| Resum: |
La capacitat dels promotors de llevat per respondre als canvis ambientals ha estat aprofitada en el passat per dirigir l'expressió de proteïnes heteròlogues. Alguns exemples inclouen el promotor CUP1, induïble per nivells moderades de coure; el MET25, actiu en condicions de limitació de metionina; o els promotors HSP12 i HSP26, que responen a l'estrès per alta temperatura i àcid acètic. Tanmateix, tot i que útils, els promotors naturals presenten limitacions quan s'utilitzen en entorns de producció industrial. Això ha motivat el desenvolupament de promotors sintètics basats en la combinació d'elements reguladors de la transcripció. En resposta a una alcalinització moderada, Saccharomyces cerevisiae desencadena una àmplia resposta transcripcional que està mediada per diverses vies de senyalització, incloent les vies calcineurina-Crz1, Snf1, Rim101 i PHO. L'alcalinització provoca una pujada gairebé immediata del Ca2+ intracel·lular que activa la fosfatasa calcineurina, la qual desfosforila el factor de transcripció Crz1, permetent la seva entrada al nucli i la seva unió ràpida a les seqüències CDRE (Calcineurin Dependent Response Element). De forma similar, l'alcalinització activa una resposta semblant a la que s'observa en condicions de manca de fosfat, provocant la translocació del factor de transcripció Pho4 al nucli, on s'uneix als elements PHO dels promotors diana, induint la transcripció. Aquestes vies de senyalització regulen l'expressió de gens implicats en l'adaptació a l'estrès, permetent a l'organisme sobreviure en condicions d'estrès alcalí. Un gen clau en aquesta resposta és ENA1, que codifica una Na⁺-ATPasa responsable de la desintoxicació de Na⁺ i Li⁺ en condicions de pH alcalí. Amb l'objectiu de construir promotors sintètics híbrids sensibles a pH alcalí, vam dissenyar construccions que contenien elements CDRE (Crz1) i PHO (Pho4) clonats upstream del promotor basal CYC1, i vam observar que eren capaços d'induir l'expressió del gen reporter yeGFP en condicions alcalines. En avaluar seqüències reguladores addicionals del promotor de ENA1 per modular l'activitat basal, vam descobrir inesperadament que un fragment d'ADN que contenia un lloc repressor Mig1/2 augmentava fortament l'expressió. Aportem evidències que aquesta regió també conté un lloc funcional d'unió pels factors de transcripció Stp1/2 (nt -553 a -544), el quals son activats per la via de detecció d'aminoàcids SPS. Aquest lloc contribueix a la inducció d'ENA1 tant pel pH alcalí com per senyals relacionades amb la disponibilitat d'aminoàcids. A més, l'expressió des d'altres promotors alcalí-induïbles com HXT2, TRX2 i SIT1 també es va reduir en un fons mutat stp1Δ stp2Δ, suggerint un paper més ampli de la via SPS en l'adaptació a condicions alcalines. A partir d'aquests resultats, hem dissenyat biblioteques aleatòries amb múltiples combinacions d'elements CDRE (Crz1) i PHO (Pho4), i hem demostrat que poden dirigir una expressió forta de GFP simplement afegint KOH al medi. L'expressió en soques deficients per Crz1 o Pho4 ens ha permès definir la contribució relativa de cadascun d'aquests elements. També hem demostrat que l'addició d'un fragment de 60 bp del promotor d'ENA1, que conté el lloc d'unió funcional de Stp1/2, millora encara més l'expressió d'alguns dels constructes mes efectius. Finalment, mostrem que aquests constructes poden dirigir una producció elevada de lacasa secretable-un enzim d'interès industrial-amb nivells d'expressió modulables segons el pH. En resum, el nostre treball presenta un nou sistema d'expressió, la inducció de la qual és senzilla, econòmica i fàcil de controlar, i que podria ser una alternativa atractiva als sistemes actuals tant per a aplicacions en recerca com en producció industrial de proteïnes. |
| Resum: |
La capacidad de los promotores de levadura para responder a cambios en el entorno ha sido aprovechada en el pasado para dirigir la expresión de proteínas heterólogas. Algunos ejemplos incluyen el promotor CUP1, inducible por cantidades moderadas de cobre; el MET25, activo en condiciones de limitación de metionina; o los promotores HSP12 y HSP26, que responden al estrés por alta temperatura y ácido acético. Sin embargo, aunque útiles, los promotores naturales presentan limitaciones cuando se emplean en entornos de producción industrial. Esto ha impulsado el desarrollo de promotores sintéticos basados en la combinación de elementos reguladores de la transcripción. En respuesta a una alcalinización moderada, Saccharomyces cerevisiae desencadena una amplia respuesta transcripcional mediada por múltiples vías de señalización, incluyendo calcineurina-Crz1, Snf1, Rim101 y PHO. La alcalinización provoca una subida casi inmediata del Ca²⁺ intracelular que activa la fosfatasa calcineurina, la cual desfosforila al factor de transcripción Crz1, permitiendo su entrada al núcleo y su unión rápida a las secuencias CDRE (Calcineurin Dependent Response Element). De forma similar, la alcalinización activa una respuesta parecida a la que se observa durante la privación de fosfato, provocando la translocación del factor de transcripción Pho4 al núcleo, donde se une a elementos PHO en los promotores de genes diana e induce su transcripción. Estas vías de señalización regulan la expresión de genes implicados en la adaptación al estrés, permitiendo que el organismo sobreviva en condiciones alcalinas. Un gen clave en esta respuesta es ENA1, que codifica una Na⁺-ATPasa responsable de la desintoxicación de Na⁺ y Li⁺ en condiciones de pH alcalino. Con el objetivo de construir promotores sintéticos híbridos sensibles a pH alcalino, diseñamos construcciones que contenían elementos CDRE (Crz1) y PHO (Pho4) upstream del promotor basal CYC1, y observamos que eran capaces de inducir la expresión del gen reportero yeGFP en condiciones alcalinas. Al evaluar secuencias reguladoras adicionales del promotor de ENA1 para modular la actividad basal, encontramos inesperadamente que un fragmento de ADN que contenía un sitio represor Mig1/2 aumentaba fuertemente la expresión. Aportamos evidencias de que esta región también contiene un sitio funcional de unión para Stp1/2 (nt -553 a -544), que son factores de transcripción activados por la vía de detección de aminoácidos SPS. Este sitio contribuye a la inducción de ENA1 tanto por pH alcalino como por señales relacionadas con la disponibilidad de aminoácidos. Además, la expresión a partir de otros promotores alcalino-inducibles como HXT2, TRX2 y SIT1 también se vio reducida en un fondo mutante stp1Δ stp2Δ, lo que sugiere un papel más amplio de la vía SPS en la adaptación a condiciones alcalinas. A partir de estos hallazgos, diseñamos bibliotecas aleatorias que contienen múltiples combinaciones de elementos CDRE (Crz1) y PHO (Pho4), y demostramos que pueden impulsar una fuerte expresión de GFP simplemente con la adición de KOH. La expresión en células deficientes en Crz1 o Pho4 nos permitió definir la contribución relativa de estos elementos a la producción de GFP. También mostramos que la adición del fragmento de 60 bp del promotor ENA1 que contiene el sitio de unión de Stp1/2 a varios de los constructos más efectivos mejora aún más la expresión. Finalmente, demostramos que estos constructos pueden dirigir la producción de una lacasa secretable-una enzima relevante a nivel industrial-con niveles de expresión ajustables mediante el pH. con niveles de expresión ajustables mediante el pH. |
| Resum: |
The ability of yeast promoters to respond to changes of the environment has been exploited in the past to drive the expression of heterologous proteins. Examples are, the CUP1 promoter, inducible by moderate amounts of copper, the MET25 promoter, active under methionine limitation, or the HSP12 and HSP26 promoters, responsive to high temperature and acetic acid stress. However, natural promoters, albeit useful, show limitations when used in the industrial production setting. This has led to the development of synthetic promoters, based on the combination of selected transcriptional regulatory elements. In response to moderate alkalinization, Saccharomyces cerevisiae develops a wide transcriptional response that is mediated by multiple signaling pathways, including the calcineurin-Crz1, Snf1, Rim101, and PHO pathways. Thus, alkalinization triggers an almost immediate burst of intracellular Ca2+ that activates the phosphatase calcineurin, promoting the dephosphorylation of the transcription factor Crz1, followed by its entry into the nucleus and rapid binding to CDRE (Calcineurin Dependent Response Element) sequences. Similarly, alkalinization initiates a response alike to that observed upon phosphate starvation, triggering the translocation of the transcription factor Pho4 to the nucleus, where it binds to PHO elements in the promoters of target genes, inducing their transcription. Therefore, these signaling networks regulate the expression of genes involved in stress adaptation, enabling the organism to survive under alkaline conditions. A key gene involved in this response is ENA1, which encodes a Na⁺-ATPase responsible for Na⁺ and Li⁺ detoxification under alkaline conditions. In an effort to construct hybrid synthetic promoters responsive to alkaline pH, we designed synthetic constructs containing CDRE (Crz1) and PHO (Pho4) elements cloned upstream of the basal CYC1 promoter, and observed that they were able to drive expression of the reporter gene yeGFP under alkaline conditions. While testing additional regulatory sequences from the ENA1 promoter to modulate basal activity, we unexpectedly found that a DNA fragment containing a known Mig1/2 repressor site strongly enhanced expression. We provide evidence that this region also contains a functional binding site for Stp1/2 (nt -553 to -544), which are transcription factors activated by the SPS amino acid-sensing pathway. This site contributes to ENA1 induction by both alkaline pH and amino acid signals. Moreover, expression from other alkali-inducible promoters such as HXT2, TRX2, and SIT1 was also reduced in a stp1Δ stp2Δ background, suggesting a broader role for the SPS pathway in alkaline adaptation. Building on these findings, we designed random libraries containing multiple combinations of CDRE (Crz1) and PHO (Pho4) elements and demonstrated that they support strong GFP expression upon simple addition of KOH. The expression in Crz1 or Pho4-deficient cells allowed us to define the relative contribution of these elements to GFP production. We also show that addition of a 60 bp fragment of the ENA1 promoter containing the Stp1/2 site further enhanced expression of several of the most active constructs. Finally, we demonstrate that these constructs drive production of a secretable laccase-an enzyme of industrial relevance- at a high level and that such expression can be modulated by adjusting the pH. In summary, our work presents a novel protein expression system whose induction is simple, cheap and easy to monitor, and that could be an attractive alternative to current expression platforms for both research and industrial protein production purposes. |
| Resum: |
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina. |
| Drets: |
Aquest document està subjecte a una llicència d'ús Creative Commons. Es permet la reproducció total o parcial, la distribució, la comunicació pública de l'obra i la creació d'obres derivades, sempre i quan aquestes es distribueixin sota la mateixa llicència que regula l'obra original i es reconegui l'autoria.  |
| Llengua: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Text ; Versió publicada |
| Matèria: |
Promotors sintètics ;
Synthetic promoters ;
Promotores sintéticos ;
Expressió gènica ;
Gene expression ;
Expresión génica ;
Saccharomyces cerevisiae ;
Ciències Experimentals |
visitant ::
identificació
