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[Barcelona] : Universitat Autònoma de Barcelona, 2019. |
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| Abstract: |
Uno de los más notables componentes en la homeostasis de cationes en levaduras es la proteína fosfatasa Ppz1. El papel de Ppz1 es doble: inhibe la entrada de potasio mediante el control de la actividad de los transportadores Trk1 y Trk2 y atenúa la expresión del gen de la Na+-ATPasa ENA1. Ppz1, está controlada negativamente por dos subunidades reguladoras estructuralmente relacionadas, Hal3 y Vhs3, siendo la primera la más relevante funcionalmente. A parte de esto se ha demostrado que niveles altos de Ppz1 son extremadamente perjudiciales para la célula. El primer objetivo de este trabajo ha sido estudiar la interacción entre Ppz1 y Hal3. A pesar de las numerosas evidencias de que ambas proteínas interaccionan físicamente, se desconoce que regiones de cada proteína están involucradas en dicha interacción y hasta qué punto es un proceso dinámico. Para ello se han diseñado dos aproximaciones experimentales, por un lado se han creado una serie de cepas con etiquetas fluorescentes en Ppz1 y Hal3, para seguir su interacción in vivo gracias al fenómeno de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) mediante citometría de flujo. Estas fusiones de Hal3 y Ppz1 con proteínas fluorescentes, además de ser completamente funcionales, han demostrado la interacción in vivo de ambas proteínas y permiten estudiar posibles variaciones en la interacción. Por otro lado, mediante experimentos de crosslinking in vitro de ambas proteínas y un posterior análisis por LC-MS/MS se han mostrado dos regiones del dominio C-terminal de Ppz1 y tres regiones de Hal3, que podrían ser las responsables de llevar a cabo esta interacción. A pesar de ser regulada negativamente por Hal3 y Vhs3, la región más N-terminal de Ppz1 es muy rica en residuos fosforilables. De hecho, el 30% de este dominio son serinas o treoninas, y algunas de ellas han sido identificadas como fosforiladas. Sin embargo, apenas ha sido estudiado que efectos funcionales pueden dar lugar cambios en el estado de fosforilación de Ppz1. En este trabajo hemos conseguido demostrar que la MAPK Hog1 fosforila a Ppz1 en la posición S265, pero este hecho no es suficiente para variar el comportamiento de la fosfatasa. Además, hemos conseguido demostrar que el estado de fosforilación de Ppz1 puede variar dependiendo de factores externos como alta concentración de sal o deficiencia de potasio. Recientemente se ha demostrado que Ppz1 es la proteína más tóxica de levadura cuando se sobredosifica. Recientemente, en nuestro laboratorio se ha verificado que la actividad fosfatasa de Ppz1 es necesaria para causar dicha toxicidad, ya que la sobreexpresión de una versión catalíticamente inactiva no causa problemas de crecimiento en las células. Sin embargo, las bases moleculares de esta toxicidad son desconocidas. En nuestro caso hemos realizado experimentos para conocer el estado del proteoma y del fosfoproteoma de S. cerevisiae cuando se sobreexpresa Ppz1, y hemos descrito una variación en el estado de fosforilación en numerosas proteínas de la levadura. De hecho se han identificado cambios importantes en proteínas relacionadas con la traducción, polarización celular, la transición G1/S del ciclo celular o con el metabolismo de carbohidratos. Además, algunos experimentos paralelos han reforzado los resultados obtenidos mediante espectrometría de masas, como la defosforilación de Mig1 y Rps6, o una hiperfosforilación de eIF2α en la Ser-51, indicando una posible inhibición en la iniciación de la traducción. En resumen los resultados obtenidos en esta tesis han puesto a punto herramientas para conocer más sobre el dinamismo de la interacción Ppz1-Hal3, han aportado datos sobre la fosforilación de Ppz1, y han generado una gran cantidad de datos de fosfoproteómica cuyo estudio detallado podría llevar a esclarecer bases moleculares de la toxicidad de Ppz1 en S. cerevisiae. |
| Abstract: |
The protein phosphatase Ppz1 is one of the most relevant components in cation homeostasis in yeast. It has two major roles: on one hand, it inhibits the potassium influx by controlling the activity of the Trk1 and Trk2 potassium transporters and, on the other hand, it represses the expression of the ENA1 gene, coding for a Na+-ATPase. Ppz1 is negatively regulated by two structurally related subunits, Hal3 and Vhs3, being Hal3 the most functionally relevant. Previous studies have shown that high levels of Ppz1 are extremely detrimental for yeast cell growth. The first objective of this work has been to study the interaction between Ppz1 and Hal3. Although there is evidence of both proteins interacting physically, the regions of each protein involved in the interaction, as well as its dynamism of the interaction, are still unknown. Therefore, two different experimental approaches have been designed. The first approach is based on the detection of fluorescence resonance energy transfer (FRET) by flow-cytometry. Several strains have been constructed with fluorescent tags on Ppz1 and Hal3, to monitor the interaction in vivo. These tagged versions of Ppz1 and Hal3, in addition to be fully functional, have been shown suitable to demonstrate the interaction in vivo between both proteins and to allow the study of possible variations on the interaction. The second approach, based on in vitro crosslinking of both proteins, followed by LC-MS/MS analysis, has shown two regions of Ppz1 C-terminal and three from Hal3 that could be involved in the interaction. Even though Ppz1 is negatively regulated by Hal3 and Vhs3, the most N-terminal region of Ppz1 is very rich in phosphorylable residues (in fact, 30 % of the N-terminal residues are serine or threonine). Some of them have been identified as phosphorylated in several studies. However, how phosphorylation could affect Ppz1 function remains unknown. In this work we show that the MAPK1 Hog1 phosphorylates Ppz1 at S265, but this is not enough to alter the behaviour of the phosphatase. Moreover, we demonstrated that the phosphorylation state of Ppz1 can change depending on external factors, such as high salt or low potassium concentrations. It has been recently demonstrated that Ppz1, when overexpressed, is the most toxic protein for yeast cells. We described in our laboratory that the phosphatase activity of Ppz1 it is crucial for this toxicity, since overexpression of a catalytically inactive version does not negatively affect cell growth. However, the molecular basis of this toxicity is still unknown. To address this question our approach was to characterize the proteomic and phosphoproteomic landscape of S. cerevisiae cells overexpressing Ppz1. We have found changes in the phosphorylation state of numerous proteins, including proteins related to translation, polarized cell growth, G1/S transition and carbon metabolism. Moreover, we provide additional evidence that reinforce the results obtained by mass-spectrometry, such in the case of Mig1 and Rps6 dephosphorylation, or hyperphosphorylation of eiF2α at Ser-51, pointing to a possible inhibition of translation initiation. Overall, the results obtained in this thesis have set tools to dynamically study in vivo the Ppz1-Hal3 interaction, have provide information on the phosphorylation of Ppz1, and have generated a large database of proteomic and phosphoproteomic data whose future analysis might provide the clues about the toxicity of Ppz1 in S. cerevisiae. |
| Note: |
Departament responsable de la tesi: Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. |
| Note: |
Tesi. Doctorat. Universitat Autònoma de Barcelona. 2019. |
| Rights: |
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| Language: |
Anglès |
| Document: |
Tesi doctoral ; Versió publicada |
| Subject: |
Proteïnes ;
Fosfatases ;
Bioquímica ;
Proteomica |
| ISBN: |
9788449088902 |
guest ::
dir.
